돌외 추출물로부터 다물린 A 및 다물린 B를 대량으로 분리하는 분리방법

본 발명은 돌외 추출물로부터 비만, 당뇨, 고지혈증 등을 포함하는 대사질환의 치료에 유용한 AMPK 활성화 유효[0009]성분인 다물린 A 및 다물린 B를 대량으로 분리하는 분리방법에 관한 것이다.

AMPK(AMP-activated protein kinase)는 α, β, γ의 서브유닛(subunit)으로 구성된 헤테로트라이머[0010](heterotrimer) 단백질로서 주로 근육 세포에 많이 존재하며, 이외에도 뇌, 심장, 지방 조직 및 간에도 존재하는 효소로서 AMPK의 작용은 세포 내에서 에너지 준위를 감지하는 중요 센서이며, 또한 이 결과에 따라식욕조절, 체중조절, 혈당조절 및 혈중지질대사 조절 등에 핵심 역할을 한다.

AMPK의 활성화는 강도 높은 운동이나 장기간 굶었을 때 나타나는 ATP 소모에 따른 AMP 농도의 증가로 AMP가[0011]

AMPK의 γ-서브유닛에 결합하여 일어난다. 실질적인 활성화는 LKB1 또는 CaMKK라는 상위 인산화 효소에 의해

AMPK α 서브유닛의 트레오닌(threonine) (Thr)-172 잔기에 대한 인산화를 통해 나타나게 된다.(Hardie DG,

Scott JW, Pan DA, Hudson ER. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system.

FEBS Lett. 2003 ; 546(1): 113-20)

인산화 형태의 AMPK는 ATP를 소비하는 생화학 반응인 지방산 및 콜레스테롤의 합성을 억제하게 되며, 반대로[0012]ATP를 생성하는 지방산의 베타산화(β-oxidation)과정과 해당작용(glycolysis)을 활성화시키게 된다. 뿐만 아니 라 세포막의 포도당 흡수 통로인 글루코스 트랜스포터 4(glucose transporter 4, GLUT4)의 양을 증가시키게 된다. 한편 AMPK의 활성화는 인슐린의 작용에 따른 PI3K 신호전달기작과 상관없이 세포 내 포도당 흡수통로인

GLUT4의 세포막이동을 증가시키게 된다. 또한 AMPK가 인산화에 의해 활성화가 되면 또 다른 하위 단백질인 콜레

스테롤 합성의 핵심 효소인 HMG-CoA 환원효소(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase)에 대한 인산화가 일어난

다. 이 결과 HMG-CoA 환원효소의 불활성화가 일어나게 되어 콜레스테롤 합성이 저하되게 되므로 혈중 콜레스테

롤이 감소된다.(Carling D.The AMP-activated protein kinase cascade-a unifying system for energy control.Treands Biochem.Sci.2004; 29(1): 18-24) 또한 인산화가 일어나 활성화된 형태의 AMPK 효소는 그 하위 작용 단백질로서 지방산 합성의 핵심효소인[0013] ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 세린(Ser)-79 잔기에 대한 인산화를 일으켜 이 ACC 효소의 활성을 억제하게 된다. 이 결과 AMPK의 활성화에 의해서 지방산의 합성에 핵심 대사산물인 말로닐-CoA(malonyl-CoA)의 생성이 저하

되어 지방산의 합성이 억제되게 된다. AMPK 활성화로 말로닐-CoA의 감소가 일어나면 미토콘드리아 내로 지방산

인 롱 체인 아실-CoA(long chain acyl-CoA)가 유입되어 베타 산화가 촉진된다. 높은 농도의 말로닐-CoA 존재 상

태에서는 롱 체인 아실-CoA를 미토콘드리아로 전달하는 CPT1(carnitine palmitoyl-CoA transferase)이 억제되

고 있는데, AMPK의 활성화로 말로닐-CoA의 농도가 저하되게 되어 이 저해 작용이 해제되면서 미토콘드리아 내로

롱 체인 아실-CoA 형태의 지방산들의 유입이 증가되면서 베타산화가 증가되므로 체지방 및 혈중 중성지질의 감

소가 일어나게 된다.(Kudo N, Barr AJ, Barr RL, Desai S, Lopaschuk GD. High Rates of Fatty Acid

Oxidation during Reperfusion ofIschemic Hearts Are Associated with a Decrease in Malonyl-CoA Levels

Due to an Increase in 5′-AMP-activated Protein Kinase Inhibition of Acetyl-CoA Carboxylase.

J.Biol.Chem. 1995; 270(29): 17513-20)한편 AMPK의 활성화는 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α)에 대한[0014]인산화를 일으키며 또한 히스톤 디아세틸라아제(histone deacetylase)의 일종인 SIRT1(Silent Information Regulatory T1)을 활성화시킨다. 이 결과 AMPK와 SITR1에 의한 PGC-1α의 인산화 및 탈아세틸화에 의해 미토콘드리아 대사가 활발히 일어나, 당뇨 및 비만의 개선 효과가 나타나게 된다(Canto and Auwerx, Curr. Opin.Lipidol. 20, 98-105, 2009; Canto 등, Nature 458, 1056-1060, 2009). 그러므로 AMPK 활성화는 체내 자방산및 콜레스테롤의 합성 억제 그리고 체지방의 베타산화 및 혈중 포도당의 세포흡수촉진 등의 작용을 촉진하기 때문에 AMPK를 활성화하는 물질은 비만, 당뇨 및 고지혈증의 개선이나 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.(Buler M, Aatsinki SM, Skoumal R, Komka Z, TM, KerkelR, Georgiadi A, Kersten S, Hakkola J. Energy-sensing factors coactivator peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α (PGC-1α)and AMP-activated protein kinase control expression of inflammatory mediators in liver: induction ofinterleukin 1 receptor antagonist.J Biol Chem. 2012 Jan 13;287(3):1847-60)

돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물이다. 산이나 들의 숲 속[0015]에서 자생하며 뿌리줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 덩굴손으로 기어 올라가기도 한다. 돌외 잎을 말려 만든 차는 주로 덩굴차라고도 불리며 원형탈모증을 없애며, 여러 장기들의 기능을 회복시키

고, 건강한 피부를 유지하게 한다. 항스트레스 효과, 이완성 및 경련성 변비 억제 효과, 지사효과 등이 있으며

기관지 천식, 노인성 만성기관지염 등에 효과가 있다. 또한 진해, 거담 작용이 있고 스트레스성 궤양에도 효과

가 있으며 간염, 동맥경화 예방, 진통작용 등이 있다고도 알려져 있다.(Razmovski-Naumovski V, Huang TH-W,

Tran VH, et al., Chemistry and pharmacology of Gynostemma pentaphyllum. Phytochem Rev 2005; 4: 197-

219)

한국공개특허 2008-0003931호에는 돌외 추출물이 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성을 증가시켜 인[0016]슐린 저항성, 비만 그리고 고지혈증 등을 포함하는 대사질환을 개선시킬 수 있음을 시사하는데 이에 대해 본 발명에서 돌외 추출물의 성분을 분석한 결과 다물린 A와 다물린 B라는 물질이 돌외 추출물에서 AMPK의 활성에 영

향을 주는 것으로 확인되었다.

또한 본 발명자들은 문헌(P. H. Nguyen et al. / Bioorg. Med. Chem. 19 (2011) 6254260)에서 돌외 추출물로부[0017]터 분리된 신규 구조의 다물린 A와 다물린 B 화합물들이 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성화제임을개시하고, 돌외 추출물로부터 상기 신규 구조의 다물린 A와 다물린 B 화합물을 분리하는 방법으로서 돌외의 50%에탄올 추출물에 HP-20 컬럼크로마터그래피법, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법 및 세미-프레퍼러티브(semi-

preparative) HPLC를 이용하여 다물린 A와 다물린 B화합물을 분리하는 방법을 개시하고 있으나, 상기 분리 방법

은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 사용함으로 인하여 실리카겔과의 흡착 등으로 인한 시료 손실 등의 문제

로 인하여 돌외 6kg으로부터 단지 다물린 A 14mg와 다물린 B 18mg 정도만 분리되는 등의 낮은 수율 및 낮은 순

도의 제조방법으로서 산업적으로 유용하지 못한 문제점을 안고 있었다.

그러나, 상기 문헌의 어디에도 돌외 추출물로부터 비만, 당뇨, 고지혈증 등을 포함하는 대사질환의 치료에 유용[0018]한 AMPK 활성화 유효 성분인 다물린 A 및 다물린 B를 대량으로 분리하는 분리방법에 대한 어떠한 내용도 교시되거나 개시된 바는 없다.

이에, 본 발명자는 선행기술에 개시된 제조방법보다 보다 높은 수율 및 고순도의 다물린 A 및 다물린 B를 대량[0019]으로 분리하는 분리방법을 발견하고, 이에 따른 다물린 A 및 다물린 B의 효과적인 분리방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다