특허권

생활성 융합단백질 및 이를 포함하는 실리카 나노입자를 포함하는 표면 코팅제

상품번호 2020031608511921
IPC 한국(KO) 등록
출원번호 1020160126932
공개번호 10-2016-0118192
등록번호 1017009080000
출원인 포항공과대학교 산학협력단
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본 발명은 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질, 상기 융합단백질에 실리카가 결합되어 형성된 실리카 나노입자를 포함하며, 생체활성과 접착성을 갖는 세포증식 또는 분화촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체 및 이의 제조방법, 상기 복합체를 포함하는 표면 코팅제, 이의 용도 및 이를 이용한 표면 코팅방법에 관한 것이다.

명 세 서
청구범위
청구항 1
홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질을 포함하는, 조골세포의 부착(attachment) 증진용 기재 표면 코팅제.
청구항 2
제1항에 있어서, 상기 코팅제는 조골세포의 증식(proliferation), 퍼짐(spreading), 및 분화(differentiation)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생체활성을 추가로 증진시키는 것을 특징으로 하는, 코팅제.
청구항 3
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열이 1회 내지 10회 연속하여 연결된 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드인, 코팅제.
청구항 4
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인, 코팅제.
청구항 5
제1항에 있어서, 상기 실리카 결합 펩타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 군에서선택되는 1종 이상인, 코팅제.
청구항 6
제1항에 있어서, 상기 기재는 고분자 화합물, 금속, 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 것인, 코팅제.
청구항 7
제6항에 있어서, 상기 고분자 화합물은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리아크릴나이트릴, 폴리게타크릴산메틸, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알긴산, 및 히아루론산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,상기 금속은 티타늄, 알루미늄, 및 스테인리스 강으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 코팅제.
청구항 8
제1항에 있어서, 상기 기재는 스텐트(stent), 인공 판막, 임플란트, 임플란트 지지대, 및 의료용 고정나사로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 의료 제품인 것인, 코팅제.
청구항 9
홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질의 실리카 결합 펩타이드에 실리카 나노입자가결합되어 형성된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 조골 세포의 부착(attachment) 증진용 기재 표면 코팅제
청구항 10
제9항에 있어서, 상기 코팅제는 조골 세포의 증식(proliferation), 퍼짐(spreading), 및 분화(differentiation)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생체활성을 추가로 증진시키는 것을 특징으로 하는,코팅제.
청구항 11
제9항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열이 1회 내지 10회 연속하여 연결된 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 구성된 군에서 선택된 펩타이드인 융합단백질인 것인, 코팅제.
청구항 12
제9항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 융합단백질인 것인, 코팅제.
청구항 13
제9항에 있어서, 상기 실리카 결합 펩타이드는 서열번호 4 내지 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 군에서선택되는 1종 이상인 것인, 코팅제.
청구항 14
제9항에 있어서, 상기 복합체는, 상기 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 방사하여 제조된 나노섬유이거나,또는 상기 융합단백질을 방사하여 제조된 나노섬유에 실리카 나노입자가 결합된 나노섬유인 것인, 코팅제.
청구항 15
제9항에 있어서, 상기 복합체는, 상기 융합단백질과 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide), PLLA), 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 고분자의 혼합물를 방사하여 제조된 나노섬유에 실리카 나노입자가 결합된 것인, 코팅제.
청구항 16
제9항에 있어서, 상기 기재는 고분자 화합물, 금속, 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 것인, 코팅제.
청구항 17
제16항에 있어서, 상기 고분자 화합물은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리아크릴나이트릴, 폴리게타크릴산메틸, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알긴산, 및 히아루론산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 금속은 티타늄,알루미늄, 및 스테인리스 강으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 코팅제.
청구항 18
제9항에 있어서, 상기 기재는 스텐트(stent), 인공 판막, 임플란트, 임플란트 지지대, 및 의료용 고정나사로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 의료 제품인 것인, 코팅제.
청구항 19
홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질을 포함하는, 조골 세포의 부착(attachment) 증진 특성을 갖는 조직공학용 지지체.
청구항 20
제19항에 있어서, 상기 지지체는 조골세포의 증식(proliferation), 퍼짐(spreading), 및 분화(differentiation)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생체활성을 추가로 증진시키는 것을 특징으로 하는,지지체.
청구항 21
제19항에 있어서, 상기 조직공학용 지지체는 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질을포함하는 조성물을 방사하여 제조된 나노섬유에 실리카 나노입자가 결합된 나노섬유 형태인 것인, 조직공학용지지체.
청구항 22
제19항에 있어서, 상기 조직공학용 지지체는 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질을포함하는 조성물과 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide), PLLA), 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어진 군에서선택되는 1종의 고분자의 혼합물을 방사하여 제조된 나노섬유에 실리카 나노입자가 결합된 것인, 조직공학용 지지체.
청구항 23
홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질을 포함하는 조골세포의 부착(attachment) 증진용 기재 표면 코팅제를 기재 표면에 부착시키고,
상기 기재 표면에 부착된 융합단백질에 실리카 나노입자를 결합시켜 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 형성하는 단계를 포함하는, 기재 표면을 코팅하는 방법.
청구항 24

제23항에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 융합단백질을 포함하는 조성물을 방사하여 제조된 나노섬유 형태로부착시키는 것인, 방법.
청구항 25
제23항에 있어서, 상기 융합단백질-실리카 나노입자 복합체는, 상기 융합단백질을 포함하는 조성물과 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide),PLLA), 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의고분자의 혼합물을 방사하여 제조된 나노섬유에 실리카 나노입자가 결합된 것인, 방법.
청구항 26
제23항에 있어서, 상기 기재는 고분자 화합물, 금속, 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
청구항 27
제26항에 있어서, 상기 기재는 스텐트(stent), 인공 판막, 임플란트, 임플란트 지지대, 및 의료용 고정나사로이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 의료용 제품인 것인, 방법.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 생활성 융합단백질 및 실리카 나노입자를 포함하는 표면 코팅제 및 [0001] 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱자세하게는 홍합 접착 단백질에 실리카를 형성하는 실리카 결합 펩타이드가 연결된 생활성 융합단백질, 상기 융합단백질에 실리카가 결합된 융합단백질-실리카 나노입자 접착성 복합체 및 이의 제조방법, 상기 복합체를 포함하는 생체활성 표면 코팅제 및 표면 코팅방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 정형외과 및 치과 수술, 외상에 의한 손상, 또는 종양 제거 등 외과적 임상치료에서는 골 손실이 발생하게되며, 이러한 골 손실 부위를 수복하기 위하여 이식재(implant) 및 대체재(substitute)가 널리 사용된다. 이때,성공적인 in vivo 단계의 치유를 위해서는 경조직의 부하를 견뎌내면서도, 동시에 골원세포를 자극하여 골 재생을 유도할 수 있는 소재의 사용이 중요하다 (Kokubo, T, Kim, HM, Kawashita, M, 2003. Biomaterials 24:2161-2175; Ter Brugge, PJ, Jansen, JA, 2002. Tissue Eng. 8: 321-331).
[0003] 실리카(silica)는 지지와 보호 기능을 담당하고, 골 손실부위에 연결조직의 침투를 막을 뿐 아니라, 골 분화 관련 유전자의 발현과 세포의 증식을 자극하는 등, 뼈를 형성하는 데 주요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다
(Wong Po Foo, C, Huang, J, Kaplan, DL, 2004. Trends Biotechnol. 22: 577-585; Karlsson, KH, Froberg, K,
Ringbom, T, 1989. J. Non-Crystalline Solids 112: 69-72; Robert, CB, Ioannis, SC, Russell, SP, Warwick,
JPR, Larry, LH, Julia, MP, 2004. Tissue Eng. 10: 1018-1022).
최근의 나노 기술 분야의 발전과 더불어 나노입자를 지니는 실리카 기반 소재들에 [0004] 관한 연구가 다양하게 진행되고 있으며, 높은 골 재생 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다 (Bosetti, M, Cannas, M, 2005.Biomaterials 26: 3873-3879; Au, AY, Au, RY, Al-Talib, TK, Eves, B, Frondoza, CG, 2008. J. Biomed.Mater. Res. 86: 678-684). 이러한 이유로 나노 단위의 실리카 성분이 결합된 임플란트 등의 이식재나 골 대체재뿐만 아니라, 카테터(catheter), 치과용 재료 및 의료 장비 코팅 등의 다양한 생체 의료 소재가 유용하게 사용될 수 있다.
[0005] 그러나, 상기 실리카 나노입자는 기존에 널리 사용되는 물리, 화학적 증착 방식으로는 소재 표면에서 쉽게 떨어지는 단점을 나타내며, 졸-겔 침전방법의 경우 산성 또는 염기성 조건과 여러 화학 첨가물을 요구함으로써 독성에 대한 잠재적인 위험성을 동반한다 (Lundgren, P, Andersson, MO, Frmer, KR, Engstrom, O, 1995.Microelectron. Eng. 28: 67-70).
[0006] 또한, 리소그래피 방법은 실리카를 생성할 표적 표면이 제한되어 있을 뿐만 아니라, 생체환경에 적합하지 않다
는 문제점을 지닌다 (Caruso, RA, Antonietti, M, 2001. Chem. Mater. 13: 3272-3282). 이러한 이유로 생체 적용에 적합하며 다양한 표면에 대한 실리카 나노입자의 고정화를 위한 효과적인 표면 고정화 전략이 필요한 실정이다.
[0007] 많은 생명체는 지지와 보호를 위하여 규조류의 껍질(frustule), 해면동물의 골편(spicule), 고등식물의 실리카식물석(silica phytolith)과 같은 실리카 기반의 구조물을 생산한다 (Iler, RK, 1979. The Chemistry ofSilica, Plenum Press: New York). 이러한 실리카 구조물 형성 과정은 실리카테인(sillicatein), 실라핀(sillafin) 등의 특징적인 단백질에 의하여 생체 내에서 발생하며, 중성의 pH, 상온 등 생체 조건과 비슷한 환경에서 진행된다 (Fan, TX, Chow, SK, Zhang, D, 2009, Prog. Mater. Sci. 54: 542-659).
[0008] 특히, 규조류인 Cylindrotheca fusiformis의 실라핀 단백질로부터 유래한 실리카 결합 펩타이드인, R5 펩타이드는 생체 환경과 비슷한 조건에서 실리카 형성을 유도 및 조절함으로써 실리카 나노입자를 형성한다 (Sumper, M,Kroger, N, 2004, J. Mater. Chem. 14: 2059-2065).
[0009] 한편, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을받지 않는다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다
(Lee, BP, Messersmith, PB, Israelachivili, JN, Waite, JH, 2011. Annu. Rev. Mater. Res. 41: 99-132).
[0010] 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에가능하다 (Lee, BP, Messersmith, PB, Israelachivili, JN, Waite, JH, 2011. Annu. Rev. Mater. Res. 41:
99-132).
[0011] 그러나, 홍합으로부터 자연 추출한 접착물질 1 그램을 얻기 위해서는 약 일만 마리의 홍합을 필요로 하기 때문에, 홍합 접착 단백질의 물성이 매우 뛰어남에도 불구하고, 자연 추출한 홍합 접착 단백질을 산업적으로 이용하기에 많은 제약이 따르고 있다. 하나의 대안으로 유전자 재조합 기술을 이용한 홍합 접착 단백질 대량생산 연구가 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus
coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 등에서 수행되고 있다 (Strausberg, RL et
al., 1989. ACS Symp. 385: 453-464; Cha, HJ, Hwang, DS, Lim, S, 2008. Biotechnol. J. 3: 631-638; Hwang,
DS, Yoo, HJ, Jun, JH, Moon, WK, Cha, HJ, 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 3352-3359).
[0012] 이러한 재조합 홍합 접착 단백질은 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 기존 홍합접착 단백질의 접착력을 유지하는 것으로 나타났다 (Hwang, DS, Gim, Y, Yoo, HJ, Cha, HJ, 2007.
Biomaterials 28: 3560-3568; Cha, HJ, Hwang, DS, Lim, S, White, JD, Matos-Perez, CR, Wilker, JJ, 2009.
Biofouling 25: 99-107).
[0013] 그러나, 대량생산이 가능하면서도 다양한 표면에 대한 접착력을 지니는 재조합 홍합 접착 단백질에 대하여, 실리카 나노입자를 결합한 홍합 유래 접착제에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 목적은 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 [0014] 융합단백질을 제공하기 위한 것이다.
[0015] 본 발명의 또 다른 목적은 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질과, 실리카 결합 펩타이드에 실리카 나노입자가 결합되어 형성된, 접착성을 가지는 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자복합체를 제공하는 것이다.
[0016] 본 발명의 또 다른 목적은 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는, 기재 표면 코팅제를 제공하는 것이다.
[0017] 본 발명의 또 다른 목적은 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 세포증식 또는 분화촉진용 조성물을제공하는 것이다.
[0018] 본 발명의 또 다른 목적은 융합단백질 또는 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.
[0019] 본 발명의 또 다른 목적은 융합단백질 또는 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 기재 표면에 코팅하는 방법을제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
[0020] 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드가 연결된 융합단백질에 관한 것이다.
[0021] 본 발명의 일구현예에서, 홍합 접착 단백질(MAP, Mussel adhesive protein)은 홍합에서 유래한 접착단백질로서, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilusgalloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
[0022] 예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 fp(foot protein)-1 내지 fp-5 단백질또는 이의 변이체를 포함하며, 바람직하게는 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus
galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및
Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
[0023] 또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-1 단백질, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-5 단백질 또는 이들의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
[0024] 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 단백질이 1 내지 10회 연속하여연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2의 연속 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 융합된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 융합리펩타이드의 예시로 서열번호 3의 fp-151 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 구체적으로,상기 홍합 접착 단백질은 하기 표 1에 나타난 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 것일 수 있다.
표 1
[0025] 서열번호 홍합 접착 단백질 아미노산 서열
1 fp-1 AKPSYPPTYK
2 fp-5 SEEYKGGYYPGNTYHYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYY
GKAKKYYYKYKNSGKYKYLKKARKYHRKGYKKYYGGSS
3 fp-151 MAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPT
YKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKPWSSEEYKGGYYPGNTY
HYHSGGSYHGSGYHGGYKGKYYGKAKKYYYKYKNSGKYKY
LKKARKYHRKGYKKYYGGSSGSAKPSYPPTYKAKPSYPPT
YKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKAKPSYPPTYKL
본 발명에 있어서 '실리카'는 테트라에틸오르소실리케이트 (TEOS), 테트라메틸오르소실리케이트 [0026] (TMOS), 메틸트리메톡시실란 (MTMS), 디메틸디메톡시실란 (DMS) 등 실리카 전구체를 이용하여 광화(mineralized)된 실리카 나노구조 일수 있으며, 예를 들어 테트라메틸오르소실리케이트 (TMOS) 및 테트라에틸오르소실리케이트 (TEOS)를이용할 수 있다.
[0027] 본 발명에 있어서, '실리카 결합 펩타이드'는 실리카와 결합 능력이 있는 R5 펩타이드일 수 있으나, 생체활성을향상시키는 실리카 입자와 결합능력이 있는 펩타이드(Patwardhan, SV, Emami, FS, Berry, RJ, Jones, SE,Naik, RR, Deschaume, O, Heinz, H, Perry, CC, 2012. J. Am. Chem. Soc. 134: 6244-6256)이면 상기에 제한되지 않으며, 구체적으로 하기 표 2에 나타난 바와 같다. 구체적으로, 상기 실리카 결합 펩타이드는 서열번호 4내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
표 2
[0028] 서열번호 펩타이드 아미노산 서열
4 R5 SSKKSGSYSGSKGSKRRIL
5 pep1 KSLSRHDHIHHH
6 Si4-1 MSPHPHPRHHHT
7 Si4-10 RGRRRLSCRLL
[0029] 또한, 구체적으로, 상기 복합체 내의 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열이 1회 내지 10회 연속하여 연결된 단백질, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[0030] 더욱 구체적으로, 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드를 연결하여 실리카 나노입자를 형성하도록 한, 생체활성을 향상시키는 복합체일 수 있으며, 상기 실리카 결합 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
[0031] 본 발명 실시예에서는 실리카 나노입자가 형성된 복합체의 생체활성 효과를 확인하였다. 구체적으로 상기 생체활성 효과는 세포 부착(attachment), 증식(proliferation), 퍼짐(spreading), 및 분화(differentiation) 등 생체조직 재생이 촉진되는 우수한 생체활성 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 10 내지 도 14).
[0032] 구체적으로, 본 발명에서는 실리카 결합 펩타이드가 결합된 융합단백질 기반의 나노섬유를 전기방사 공정을 이용하여 제조하였으며, 도 15 및 16에 나타난 바와 같이, 나노 섬유 표면에 실리카 나노입자를 형성시켰다.
[0033] 본 발명의 융합단백질을 고분자와 함께 혼합하여 합성고분자 용액을 제조한 후 전기방사를 통하여 나노 섬유를조할 수 있으며, 상기 고분자는 대부분의 생분해성 고분자들을 포함할 수 있다.
[0034] 예를 들어, HFIP 용매에 용해되면서 전기 방사가 잘 이루어진다고 알려진 폴리카프로락톤(polycaprolactone,PCL), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide), PLLA) 및 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA)와, 물에 용해될 수 있다고 알려진 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA) 등을 예시할 수 있다.
[0035] 상기 전기방사 공정은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전시킬 때 발생하는 전기적 인력 및척력을 이용하여 섬유를 형성시키는 기술로서, 수 nm 내지 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 섬유를 제조할수 있으며, 장비 구조가 간단하고, 광범위한 재료에 적용이 가능하고, 기존의 섬유에 비하여 공극률이 증가되어부피 대비 표면적이 큰 섬유 제조가 가능하다.
[0036] 또한, 융합단백질과 생분해성 고분자를 다양한 비율로 혼합하여 전기방사를 통하여 나노 섬유를 제조할 수있다. 예를 들어, 생분해성 고분자와 융합단백질을 90:10 내지 10:90, 바람직하게는 80:20 내지 70:30 (w/w),더욱 바람직하게는 50:50(w/w)의 비율로 혼합한 후 전기방사를 통하여 나노 섬유를 제조할 수 있다.
또한, 상기 나노섬유를 이온화된 실리카를 포함하는 용액에 침지하여 [0037] 표면에 실리카 나노입자를 형성할 수있다.
[0038] 본 발명의 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는, 기재 표면 코팅제에 관한 것이다.
[0039] 구체적으로, 상기 기재는 스텐트(stent), 인공 판막, 임플란트, 임플란트 지지대 및 의료용 고정나사로 이루어진 군에서 선택되는 의료용 제품일 수 있으며, 또는 고분자 화합물, 금속, 및 유리 등 일 수 있다. 상기 고분자화합물은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리아크릴나이트릴, 폴리케타크릴산메틸, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알긴산,및 히아루론산 등 일 수 있으며, 상기 금속은 티타늄, 알루미늄, 및 스테인리스 강 등을 포함하는 것일 수있다.
[0040] 본 발명의 또 다른 일구현예는 실리카 이온을 포함하는 용액에, 홍합 접착 단백질과 실리카 결합 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 실리카 이온 용액에 침지하여 상기 실리카 결합 펩타이드에 실리카 나노입자를 형성하는단계를 포함하는, 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체 제조방법에 관한 것이다.

[0041] 또한 구체적으로, 상기 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체는 홍합 접착 단백질에 실리카결합 펩타이드가 연결된 융합단백질과, 상기 융합단백질의 실리카 결합 펩타이드에 실리카 성분이 결합되어 형성된 실리카 나노입자를 포함하고, 생체활성능 및 접착성을 가지는 단백질-산화물 나노입자 복합체일 수으며, 융합단백질 단독, 또는 융합단백질과 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide), PLLA), 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 고분자의 혼합물의 방사로 제조된 나노섬유 형태일 수 있다.
[0042] 본 발명의 또 다른 일구현예는 홍합 접착 단백질에 실리카 결합 펩타이드를 연결하여 제조한 융합단백질을 코팅대상 표면에 접착시키는 단계; 및 상기 융합단백질이 접착된 표면에 실리카를 결합시켜 실리카 나노입자를 형성하는 단계를 포함하는, 기재 표면 코팅 방법에 관한 것이다.
[0043] 또한, 구체적으로 상기 복합체는 융합단백질 단독, 또는 융합단백질과 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL),
폴리디옥사논(polydioxanone, PDO), 폴리-L-락타이드 (poly(L-lactide), PLLA), 폴리-(DL-락타이드-코-글리콜리드)(poly(DL-lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 고분자의 혼합물의 방사로 제조된 나노섬유형태일 수 있다.
[0044] 본 발명의 또 다른 일구현예는 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 코팅제로표면이 코팅된 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
[0045] 조직공학 기술은 인공피부, 인공연골, 인공뼈, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용될수 있으며, 세포에 무해하고 실제 생체조직과 비슷한 물성을 갖는 지지체를 형성하는 것이 중요하다.
[0046] 본 발명의 홍합 접착 단백질과 실리카 결합 펩타이드의 융합단백질, 또는 상기 융합단백질에 실리카 나노입자가결합된 복합체는 조직공학 기술에서 조직의 결함을 채우는 역할뿐만 아니라 생체 조직 및 장기의 재생을 촉진시키는, 생체조직과 유사한 지지체를 제공할 수 있다.
[0047] 상기 세포는 원핵세포 및 진핵 세포를 포함하는 모든 세포일 수 있고, 일 예로 섬유세포(fibroblast), 조골세포(osteoblast), 신경세포(neurons), B cell 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수도 있다.
발명의 효과
[0048] 본 발명은 실리카 나노입자가 홍합 접착 단백질에 결합될 수 있도록 함으로써, 생체 활성 효과를 나타내는 세포증식 또는 분화촉진용 코팅제로 사용될 수 있으며, 홍합 접착 단백질의 우수한 접착력을 이용하여 표면에 관계없이 다양한 표면에 코팅이 가능하도록 하는 장점이 있다.
도면의 간단한 설명
[0049] 도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 티타늄 임플란트의 표면에 실리카 나노입자가 코팅되고 그 위에 조골세포가결합된 형태로서 생체활성 효과를 나타내는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 기재 표면에 홍합 접착 단백질 기반의 융합단백질을 코팅하여 실리카 나노입자를 형성하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 R5-MAP 융합단백질을 제작하기 위한 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 R5-MAP 융합단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 폴리머 표면에 코팅된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 분석을 통하여 실리카 나노입자의 형태를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 티타늄 표면에 코팅된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 분석 그림을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 알루미늄 표면에 코팅된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 주사 전자 현경(scanning electron microscopy, SEM) 분석 그림을 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 스테인리스 강 표면에 코팅된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM) 분석 그림을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 기재 표면에 코팅된 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 에너지 분산 X-선분광 분석 (Energy dispersion X-ray spectroscopy, EDS)을 통해 실리카 나노입자의 형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포 부착 정도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포 증식 정도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포의 퍼짐 능력을 분석하기 위한 DAPI 및 FITC에 의한 형광 염색 그림이다.
도 13은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포의 분화정도를 분석하기 위한 alizarin-red S 염색 그림이다.
도 14는 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포의 분화 결과 세포 내 칼슘 침착 능력을 분석하기 위한 침착 칼슘의 정량 결과이다.
도 15는 R5-MAP 융합단백질 기반(R5-MAP / PCL 혼합, 50:50 (w/w))의 나노섬유를 나타낸 것이다.
도 16은 R5-MAP 융합단백질 기반(R5-MAP / PCL 혼합, 50:50 (w/w))의 나노섬유에 TMOS 용액을 처리하여 나노섬유 표면에 형성된 실리카 나노입자를 나타낸 것이다.
도 17은 에너지 분산 X-선 분광 분석 (EDS)을 통해 나노섬유 표면의 실리카 나노입자의 형성을 확인한 결과를나타낸 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 [0050] 예시하는 것일 뿐, 본 발명이하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[0052] 실시예 1. 융합단백질의 제조
[0053] 규조류인 C. fusiformis로부터 유래한 실리카 결합 펩타이드 서열에 대한 프라이머(표 3)를 제작하였다. 상기프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응을 통해, 홍합 접착 단백질 fp-1(서열번호 1) 및 fp-151(서열번호 3)에 실리카 결합 펩타이드 를 연결한 융합 단백질을 제조하였다.
표 3
[0054] 서열
번호
Primer Nucleotide sequence (5'→ 3')
8 Forward for R5 GCGCCATATGAGCAGCAAAAAATCTGGCTCCTATTCAGGCTCGAAAGGTTCTAAACGTCGCATTCTGGGTGG
CGGAGGGGCGAAACCGAGCTATCCGCCGACC
9 Reverse for MAP GCGCCTCGAGCTTGTACGTTGGAGGATAAGAAGG
[0055] 도 3에 따른 융합단백질(R5-MAP)의 제조 모식도에 나타낸 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-1 또는 fp-151와 같은 홍합 접착 단백질(MAP)에 R5 펩타이드(서열번호 5; SSKKSGSYSGSKGSKRRIL)를 연결하였다. T7 프로모터를 포함하는 pET-22b(+) 벡터를 플라스미드 운반체로 사용하였으며, 대장균 TOP10 균주에 형질전환하였다. 또한, 융합단백질의 발현을 위하여, 클로닝된 재조합 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 다시 형질전환하였다.
[0056] R5-MAP의 융합 단백질을 암호화하는 핵산서열로 형질전환된 대장균을 50μg/ml의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 액체배지에서 37 ℃, 300 rpm의 조건으로 배양하였으며, 600 nm에 대한 광학 밀도(optical density;OD600)가 0.4 내지 0.6 수준에 이르렀을 때, 1 mM의 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여동일 조건에서 8시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 4 ℃, 18,000 × g의 조건에서 10분 동안 원심분리하였으며, 용출 버퍼(10 mM Tris-HCl, 및 100 mM sodium phosphate, pH 8)에 재부유하여 200 Kpsi의 조건에서 세포파쇄를 진행하였다. 이를 통해 얻은 세포 용해물(cell lysate)로부터 세포 파괴물(cell debris)를 얻어내기 위하여 4 ℃, 18,000 × g의 조건에서 20분 동안 원심분리하였으며, 25%(v/v) 아세트산을 이용하여 목적 융합단백질을 추출하고, 최종적으로 정제된 융합단백질은 동결건조를 거친 후 -80 ℃에서 보관하였다.
[0057] 각 단백질에 대한 생산 및 정제는 12%(w/v) SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 융합단백질이 성공적으로 발현됨을전기영동법으로 확인하였으며 전기영동결과 사진을 도 4에 나타냈다. 상기 융합단백질의 농도는 Bradfordassay(Bio-Rad)를 통해 측정하였다.
[0059] 실시예 2: 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 제조
[0060] 2-1: 폴리머 기재 표면을 이용
[0061] 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 폴리스티렌 재질의 커버 슬립 표면에 코팅하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 융합단백질을 5 mg/ml의 농도로 포함하는 5% 아세트산 용액을 상기 기재 표면위에 적용하여 12시간 동안상온에서 보관함으로써 단백질의 증착(deposition)을 진행하였다. 이때, 각 표면에 제대로 접착하지 않은 융합단백질을 제거하기 위하여 증류수로 세척한 후에, 기재 표면에 코팅된 융합단백질(R5-MAP)을 얻었다.
[0062] 융합단백질로 코팅된 기재 표면을 1M의 테트라메틸실록산(TMOS, trimethylorthosilicate) 용액에 2분 동안 보관함으로써, 융합단백질에 실리카 나노입자가 결합된 복합체를 제조하였으며, 상기 기재 표면에 제대로 결합하지않은 실리카를 제거하기 위하여 증류수로 세척하였다.
[0063] 상기 제조한 융합단백질-실리카 나노입자 복합체(Si-R5-MAP)의 형성 여부를확인하고 복합체의 형태를 조사하고자, 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM)으로 분석하고 그 결과 얻어진 SEM 사진을 도 5에나타냈다.
[0064] 도 5는 폴리머 표면에 코팅된 단백질-실리카 나노구조 복합체의 주사 전자 현미경(scanning electronmicroscopy, SEM) 분석 그림을 나타낸 것이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질의표면에서 형성된 입자는 약 100 nm의 크기를 가지며, 둥근 구형 실리카 입자로 나타났다.
[0066] 2-2: 금속 기재 표면을 이용
[0067] 실시예 2-1과 실질적으로 동일한 방법으로, 티타늄, 알루미늄, 및 스테인리스 강 표면을 실시예 1에서 제조한융합단백질로 코팅하고, 융합단백질로 코팅된 기재 표면을 1 M의 테트라메틸실록산(TMOS,
trimethylorthosilicate) 용액으로 실리카를 결합시켜 융합단백질-실리카 나노입자 복합체(Si-R5-MAP)를 형성하였다.
[0068] 상기 표면을 분석하여 SEM 사진을 찍어, 티타늄 표면에 융합단백질-실리카 나노입자 복합체(Si-R5-MAP)를 형성한 결과를 도 6에 나타내고, 알루미늄 표면에 융합단백질-실리카 나노입자 복합체(Si-R5-MAP)를 형성한 결과를도 7에 나타내고, 스테인리스 강 표면에 융합단백질-실리카 나노입자 복합체(Si-R5-MAP)를 형성한 결과를 도 8에 나타냈다.
도 6 내지 도 8에 나타난 바와 같이 R5-MAP 융합단백질이 티타늄, 알루미늄, [0069] 및 스테인리스 강 표면에서 성공적으로 코팅된 후, TMOS 용액에 의해 실리카 나노입자를 형성하는 것을 확인하였다.
[0071] 2-3: 코팅표면의 실리카 원소분석
[0072] 실시예 2-1에서 얻어진 기재의 코팅 표면의 구조를 분석하고자 에너지 분산 X-선 분광 분석 (Energy dispersionX-ray spectroscopy, EDS)를 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다.
[0073] 도 9는 에너지 분산 X-선 분광 분석 (Energy dispersion X-ray spectroscopy, EDS)을 통해 실리카 나노구조의형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 9에 나타난 바와 같이 입자의 원소 구성을 에너지 분산 X-선 분광 분석 (Energy dispersion X-ray spectroscopy, EDS)를 통해 생성된 나노입자의 구성원소가 실리카라는 것을 확인하였다.
[0075] 실시예 3: 표면 코팅제의 in vitro 세포 실험
[0076] 3-1: 표면코팅제를 이용한 세포배양
[0077] 실시예 2의 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 생체활성 표면 코팅제의 in vitro 단계에서의 세포기능 향상 능력을 분석하고자 하였다.
[0078] 실시예 2-1과 동일한 방법으로, 폴리스티렌 커버 슬립 표면의 처리를 코팅한 네 가지 기재 표면 코팅물을 준비하였다. 구체적으로 네 가지의 표면 코팅물은, 1) 융합단백질과 TMOS 두 가지 모두를 코팅하지 않은 폴리스티렌커버 슬립 표면(NC), 2) TMOS 용액이 처리되고 R5-MAP 융합단백질은 코팅되지 않은 표면물질 (Si-NC), 3) TMOS용액이 처리되지 않고 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 표면물질 (R5-MAP), 및 4) TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 표면(Si-R5-MAP)을 준비하였다.
상기 준비된 4가지 표면에서 5×104
[0079] 개의 쥐 조골세포 MC3T3-E1을 배양하였다.
[0081] 3-2: 광학밀도 (optical density)를 이용한 세포부착 및 증식평가
[0082] 상기 세포 배양 결과, 3) TMOS 용액이 처리되지 않고 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 표면물질 (R5-MAP) 및 4)TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 표면(Si-R5-MAP)이, 1) 융합단백질과 TMOS 두 가지 모두를 코팅하지 않은 폴리스티렌 커버 슬립 표면(NC) 및 2) TMOS 용액이 처리되고R5-MAP 융합단백질은 코팅되지 않은 표면물질 (Si-NC) 에 비해 높은 세포 부착 및 증식을 나타내었으며, 4)TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 표면(Si-R5-MAP)가 더욱우수한 세포증식 효과를 나타내었다.
[0083] 상기 4가지 표면에서 쥐 조골세포를 72시간까지 배양하고, 상기 표면의 optical density을 측정하였으며 그 결과를 도 10 및 11에 나타냈다.
[0084] 도 10은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐조골세포 부착 정도를 나타낸 그래프이다. 도 11은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질 및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포 증식 정도를 나타낸 그래프이다.
[0085] 세포 증식의 경우 R5-MAP 단백질 자체와 실리카 나노입자가 세포의 부착과 증식에 어느 정도 효과를 나타냄을확인하였다 (도 10 및 도 11).
[0087] 3-3: 형광염색을 이용한 세포퍼짐능력 평가
[0088] 상기 4가지 표면에서 쥐 조골세포를 1일 동안 배양한 후 형광염색을 진행한 결과를 도 12에 나타냈다. 도 11는융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질 및 TMOS용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐 조골세포의 퍼짐 능력을 분석하기 위한 DAPI 및 FITC에 의한 형광 염색 그림이다.
[0089] 도 12에 나타난 바와 같이, R5-MAP 융합단백질로 코팅 후 TMOS 용액을 처리함으로써 실리카 나노입자가 형성된폴리스티렌 커버 슬립 표면에서 쥐 조골세포를 1일 동안 배양한 후 형광염색을 진행한 결과, 실리카가 형성된표면과, TMOS 용액을 처리하지 않아 실리카가 형성되지 않은 R5-MAP 코팅 표면 모두에서 대조군 표면에 비해 세포가 길게 퍼지는 현상을 관찰하였으며, 이로부터 R5-MAP 단백질 자체와 실리카 나노입자가 세포의 형태에도 효과를 나타냄을 확인하였다.
3-4: alizarin red [0091] S 염색을 이용한 세포분화 평가
[0092] 세포의 분화 양상을 확인하기 위하여, 상기 4가지 표면을 이용하여 쥐조골세포를 15일 동안 배양한 후 alizarinred S 염색을 수행하였으며 그 결과를 도 13에 나타냈다. alizarin red S 염색은 석회화된 골기질을 평가하는데가장 많이 사용하는 방법 중의 하나이며 석회화된 골기질 형성정도는 조골세포의 표지자로 알려져 있다. 구체적으로, 배양된 조골세포를 인산염 식염수로 세척하고 4% 포름알데히드로 10분간 고정하였다. 2% alizarin red S용액으로 5분간 부드럽게 진탕한 후 탈염수로 여러 번 세척하여 여분의 염색액을 제거하고 염색양상을 관찰하였다.
[0093] 도 13은 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질 각각의 표면에서의 쥐조골세포의 분화를 분석하기 위한 alizarin-red S 염색 그림이다.
[0094] 도 13에 나타난 바와 같이, R5-MAP 융합단백질로 코팅 후 TMOS 용액을 처리함으로써 실리카 나노입자가 형성된폴리스티렌 커버 슬립 표면에서 세포의 분화 양상을 확인하기 위하여 쥐 조골세포를 15일 동안 배양한 후alizarin red S 염색을 진행한 결과, 실리카가 형성된 표면에서 대조군 표면(NC 및 Si-NC)에 비해 붉은 색으로염색되는 현상을 관찰하였다.
[0096] 3-5: 칼슘침착량 분석
[0097] 상기 4가지 표면의 세포증식물에 대해서, 10% 아세트산을 처리하여 칼슘을 얻고 칼슘량을 측정하여 그 결과를도 13에 나타냈다. 도 14는 융합단백질이 코팅되지 않은 표면물질, TMOS 용액이 처리되지 않은 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 물질 및 TMOS 용액 처리 후 생성된 R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 물질각각의 표면에서의 쥐 조골세포의 분화 결과 세포 내 칼슘 침착 능력을 분석하기 위한 침착 칼슘의 정량 결과이다.
[0098] 도 14에 나타난 바와 같이, 10% 아세트산에 용출하여 염색 정도를 정량화한 결과 실리카가 형성된 표면에서 기질 내에 생성된 칼슘의 양이 대조군 표면에 비해 높게 나타났다. 후기 조골세포 분화 지표인 기질 내 칼슘량은3) TMOS 용액이 처리되지 않고 R5-MAP 융합단백질로 코팅된 표면물질 (R5-MAP) 및 4) TMOS 용액 처리 후 생성된R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 표면에서 대조군인 1) 융합단백질과 TMOS 두 가지 모두를 코팅하지 않은 폴리스티렌 커버 슬립 표면(NC) 및 2) TMOS 용액이 처리되고 R5-MAP 융합단백질은 코팅되지않은 표면물질 (Si-NC)에 비해서 높게 나타냈으며, 또한 R5-MAP 융합단백질만을 처리한 3)표면에 비해서, 4)R5-MAP 융합 융합단백질-실리카 나노입자 복합체로 코팅된 표면이 더욱 우수한 결과를 나타냈다. 이로부터 R5-MAP 단백질 자체와 실리카 나노입자가 세포의 분화에 효과를 나타냄을 확인하였다.
[0100] 실시예 4: 나노 섬유를 이용한 표면 코팅제 제조
[0101] 4-1: 융합단백질의 나노섬유를 이용한 코팅제
[0102] R5-MAP 융합단백질과 합성 고분자인 PCL (polycaprolactone) 용액을 블렌딩하여 전기방사 기술을 이용하였다.
[0103] 구체적으로, 전기방사를 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 융합단백질과 polycaprolactone (PCL)을 각각 6.5wt%의 농도로 hexafluoroisopropanol(HFIP)에 녹여 준비하였다. 이후, polycaprolactone(PCL) 용액과 R5-MAP융합단백질 용액을 5:5의 비율로 섞은 후, 바늘의 직경이 0.4 mm이고 질량 흐름 속도가 0.3 ml/h인 5 ml의 시린지에서 전기방사하였다. 이때, 시린지에 붙어있는 바늘의 끝에 고전압(8 내지 10 kV)을 걸어주면서 나노 섬유를생성시키는 방식으로 진행하였으며, 생성된 나노 섬유는 바늘의 팁으로부터 10 cm 거리를 두고 알루미늄 호일표면에서 무작위로 수집되었다. 생성된 나노 섬유는 도 15에 나타난 바와 같다.
[0104] 도 15는 R5-MAP 융합단백질 기반(R5-MAP / PCL 혼합, 50:50 (w/w))의 나노섬유를 나타낸 것이다.
[0106] 4-2: 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 나노섬유를 이용한 코팅제
[0107] 실시예 4-1에서 제조된 융합단백질(R5-MAP) 나노 섬유는 남아있는 용매를 증발시키기 위하여, 최소 3일 동안 진공상태에서 건조하였다.
건조된 R5-MAP 나노 섬유를 TMOS 용액에서 약 30초간 처리하여 섬유 표면에 [0108] 실리카 나노입자를 결합시켜 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 나노섬유를 제조하였다. 상기 얻어진 융합단백질-실리카 나노입자 복합체의 나노섬유의 사진을 도 15에 나타냈다.
[0109] 도 16은 R5-MAP 융합단백질 기반(R5-MAP / PCL 혼합, 50:50 (w/w))의 나노섬유에 TMOS 용액을 처리하여 나노섬유 표면에 형성된 실리카 나노입자를 나타낸 것이다.
[0111] 4-3: 코팅표면의 실리카 원소분석
[0112] 실시예 4-1에서 융합단백질(R5-MAP) 나노 섬유에 결합된 실리카 나노입자를 포함하는 복합체 나노섬유에대해서, 에너지 분산 X-선 분광 분석 (Energy dispersion X-ray spectroscopy, EDS)을 수행하였으며, 그 결과를 도 17에 나타냈다. 도 17은 에너지 분산 X-선 분광 분석 (Energy dispersion X-ray spectroscopy, EDS)을통해 실리카 나노구조의 형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[0113] 도 17에 나타난 바와 같이 EDS 표면성분 분석을 통하여, 형성된 실리카가 표면의 약 29%를 차지함을확인하였다. 이로부터 본 발명 생체조직 재생촉진용 융합단백질-실리카 나노입자 복합체를 포함하는 표면 코팅제로 코팅된 나노 섬유를 제조하였다.
【심사관 직권보정사항】
【직권보정 1】
【보정항목】청구범위
【보정세부항목】청구항 9
【변경전】
융합단백질-실라카
【변경후】
융합단백질-실리카 

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