갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 조성물

청구범위
청구항 1
펩티도글리칸으로 처리한 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물.
청구항 2
제1항에 있어서,상기 갯지렁이 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜,디프로필렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 부틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄 및 헥산 중 선택된 어느 하나 이상을 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화또는 항염용 화장료 조성물.
청구항 3
삭제
청구항 4
제1항에 있어서,상기 펩티도글리칸은 갯지렁이에 10~1,000ppm의 농도로 처리된 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염용 화장료조성물.
청구항 5
제1항에 있어서,상기 갯지렁이 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 5~50중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물.
청구항 6
펩티도글리칸으로 처리한 갯지렁이(Perinereis linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 심장질환, 암, 당뇨병,뇌혈관 질환, 동맥경화증, 이들의 합병증 중에서 선택되는 산화적 스트레스에 의한 질환, 또는 염증에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 7
제6항에 있어서,상기 염증에 의한 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 백내장, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 폐혈증, 위궤양, 위염, 크론병, 치질, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선, 관절염, 골관절염,류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 다발성 경화증, 당뇨병, 피부경화증, 통풍, 퇴행성 신경질환, 규폐증, 죽상동맥경화증 및 허혈 중 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 8
삭제
청구항 9
펩티도글리칸으로 처리한 갯지렁이(Perinereis linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 식품 조성물.
청구항 10
펩티도글리칸으로 처리한 갯지렁이(Perinereis linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 사료 조성물.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 [0001] 또는 항염용 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 염증 반응은 감염으로 인한 대식세포의 외부 침입 물질에 대한 방어기전이며, 발전, 발열, 통증과 같은 증상을수반한다. 대식세포가 활성화되면, 많은 염증성 인자들을 생산하는데, 그 인자들에는 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin(IL), leukotrienes, nitric oxide(NO) 등이 있다. 과도한 염증인자의 생산은 류마티스성 관절염, 천식, 호흡기 질환, 폐혈증 등의 질환을 유발하는 중요한 지표가 된다.
[0003] 대식세포는 대표적인 염증 매개물인 NO(nitric oxide) 생성에 관여하며, 급성 및 만성염증 반응에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된다. NO는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 특히 대식세포에서 리포 다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 자극하면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 발현되어 NO를 생성하게 된다. 그러므로 NO의 과량 생성은 염증반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 또한 COX-2(cyclooxygenase-2)는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 염증매개물질인 PGE2(prostaglandin E2) 생성을촉매하는 효소로, iNOS와 마찬가지로 염증반응에 중요한 역할을 한다. 또한 LPS에 의한 대식세포의 활성 시interleukin(IL)-1β 및 tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 같은 염증인자 등을 생산하게 된다. 생체의 산화반응 과정 중에 생성되는 활성산소들은 체내의 항산화효소(superoxide dismutase, catalase, glutathioneperoxidase)에 의해 제거되나, 이를 초과한 과량의 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)으로 인한 산화적 스트레스가 항산화물질에 의해 감소된다. 최근 염증에 의한 질병에 활성산소종이 관련되어 있다고 보고되었으며, Miesel 등은 매우 독성이 강한 산화제인 슈퍼옥사이드(superoxide)를 포함하는 활성산소종은 염증기간 동안에 조직 손상을 직접 초래할 수 있다고 보고하였다. 따라서 NO의 생성이나 iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의발현 억제와 염증에 의한 활성산소종의 억제는 염증질환을 치료하는데 있어서 중요한 목표가 된다.
[0004] 한편, 갯지렁이(Perinereis Linea)는 해양 갯지렁이(marine clamworm)의 한 종류로 동양의학에서 수백 년 전부터 한방의약에 사용되어 왔다. 또한 갯지렁이에서 자이언트 헤모글로빈(giant hemoglobin)과 섬유소 용해 단백질(fibrinolytic protein)의 존재가 보고되었다. 갯지렁이는 지렁이와 비슷한 종류의 환영동물(annelid)이나,지렁이(Eisenia andrei) 추출물에 대한 연구조차 많이 진행되지 않았으며 갯지렁이에 대한 항염증, 항산화 연구는 거의 보고된 바가 없다.
선행기술문헌
특허문헌
[0005] (특허문헌 0001) 국내공개특허 제10-2005-0112411호
발명의 내용
해결하려는 과제
[0006] 본 발명에서는 갯지렁이 추출물이 LPS로 유도한 대식세포에서 항염증 관련 인자 NO, iNOS, IL-1β, TNF-α,COX-2의 억제 효과를 확인하고, 항산화 관련 인자인 카탈라아제(catalase), SOD, 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase, GSH-Px) 및 자유 말론디알데하이드(free malondialdehyde, MDA) 측정을 통한 항산화효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
[0007] 이에 본 발명은 항산화 및 항염증 활성을 가지는 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하여 항산화 효과를 가지며, 염증 및 염증으로 야기되는 질환에 대한 예방, 개선, 치료 효과를 가져 의약품, 식품, 화장료, 사료첨가제,사료로 유용하게 사용할 수 있는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제의 해결 수단
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 [0008] 유효성분으로 포함하는 항산화또는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
[0009] 또한 본 발명은 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 또는 염증에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[0010] 또한 본 발명은 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 식품 조성물을 제공한다.
[0011] 또한 본 발명은 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 사료 조성물을 제공한다.
발명의 효과
[0012] 본 발명에 따르면 항산화 및 항염증 활성을 가지는 갯지렁이 추출물과, 이를 유효성분으로 포함하여 항산화 효과를 가지며, 염증 및 염증으로 야기되는 질환에 대한 예방, 개선, 치료 효과를 가져 의약품, 식품, 화장료, 사료, 사료첨가제로 유용하게 사용할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0013] 도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 갯지렁이 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 갯지렁이 추출물이 지질과산화 억제에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 갯지렁이 추출물과 일반지렁이 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 마우스의COX-2 및 iNOS 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 3A는 웨스턴 블롯 결과, 도 3B는 iNOS의 결과, 도 3C는COX-2의 결과이다.
도 4는 발명의 일실시예에 따라 갯지렁이 추출물과 일반지렁이 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 마우스의IL-1β에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물이 지질과산화 억제에 미치는 영향을나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 마우스의 COX-2, iNOS 및 NO 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 3A는 웨스턴 블롯 결과, 도 3B는 iNOS의 결과,도 3C는 COX-2의 결과, 도 3D는 NO 생산 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 마우스의 IL-1β와 TNF-α에 미치는 영향을 나타낸 도이다. 도 4A는 IL-1β의 결과이며, 도 4B는 TNF-α의 결과이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0014] 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
[0015] 본 발명은 갯지렁이(Perinereis Linea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 조성물을제공한다.
[0016] 본 발명에서 용어 "추출물"은 갯지렁이를 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는것으로, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물,이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
[0017] 상기 갯지렁이 추출물은 당업계에 공지된 추출, 분리 및 분획하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출, 분리 및분획하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 정의된 '추출물'은 적절한 용매를 이용하여 갯지렁이로부터추출한 것이며, 예를 들어 갯지렁이의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
상기 갯지렁이로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 [0018] 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 용매로는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol)등의 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 부틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄,헥산 등을 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 용매로는 에탄올 또는 물을 사용하는 것이 바람직하다.
[0019] 또한 추출방법으로는 상온추출법, 열수추출법, 냉침추출법, 환류추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법이 사용될 수 있다.
[0020] 상기 갯지렁이 추출물은 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해분말 상태로 제조할 수도 있다.
[0021] 또한 본 발명의 갯지렁이 추출물은 펩티도글리칸으로 처리된 갯지렁이로부터 추출된 것이 바람직하다.
[0022] 보다 구체적으로, 상기 갯지렁이 추출물은 갯지렁이 채강 내 펩티도글리칸을 주입하는 단계; 상기 펩티도글리칸이 주입된 갯지렁이로부터 추출물을 제조하는 단계;로 제조할 수 있다.
[0023] 펩티도글리칸(peptidoglycan)은 외부물질에 대한 자가면역 반응을 유도하여 선천적 면역활성을 유도하는물질로, 본 발명에서는 갯지렁이에 펩티도글리칸을 처리하여 추출물을 제조함으로써 갯지렁이 추출물의 항산화및 항염증 활성을 더욱 증대시킬 수 있다.
[0024] 상기 펩티도글리칸은 갯지렁이에 10~1,000ppm의 농도로 주입되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는10~500ppm으로 주입되는 것이며, 가장 바람직하게는 10~100ppm으로 주입되는 것이다. 펩티도글리칸의 농도가10ppm 미만일 경우에는 항산화 및 항염증 효과를 기대할 수 없고, 1,000ppm을 초과할 경우에는 더 효율적인 항산화, 항염증 효과를 기대할 수 없다.
[0025] 상기 주입 후에는 일정 시간 동안 펩티도글리칸을 활성화시킨 다음 추출단계를 수행한다.
[0026] 상기와 같은 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물은 항산화 또는 항염증 조성물에 5~50중량%의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10~30중량%의 농도로 포함되는 것이다. 그 함량이 5중량% 미만일 경우에는 항산화 및 항염증 효과를 기대할 수 없고, 50중량%를 초과할 경우에는 사용되는 갯지렁이 추출물 대비 항산화 및 항염증 효율을 얻을 수 없다.
[0027] 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 갯지렁이 추출물 또는 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물은 지질과산화 억제를 통해 항산화 물질인 catalase, SOD 및 GSH-Px를 증가시키고, 염증물질인 iNOS, COX-2, 및 IL-1β의억제에서도 우수한 효율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물은 항산화 또는 항염용 화장료, 약학, 식품 및 사료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
[0028] 본 발명은 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
[0029] 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제,용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제 및 담체가 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있다.
[0030] 본 발명의 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 마스크팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, [0031] 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분,트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될수 있다.
[0032] 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.
[0033] 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고,구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
[0034] 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 포함될 수 있다.
[0035] 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.
[0036] 본 발명은 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스 또는 염증에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[0037] 상기 염증에 의한 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 백내장, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 폐혈증, 위궤양, 위염, 크론병, 치질, 강직성 척추염, 루푸스, 섬유근통, 건선, 관절염, 골관절염,류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 다발성 경화증, 당뇨병, 피부경화증, 통풍, 퇴행성 신경질환, 규폐증, 죽상동맥경화증, 허혈 등일 수 있다.
[0038] 상기 산화적 스트레스에 의한 질환은 노인성 질환 중 심장질환, 암, 당뇨병, 뇌혈관 질환, 동맥경화증 등일 수있으며, 특히 당뇨병에서 혈관합병증의 발생 및 노화관련 질병에 산화적 스트레스가 중요한 요인이라고 인식되고 있다.
[0039] 한편, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대,산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 피부외용제의 형태로 제공되는것이 가장 바람직할 수 있다. 구체적으로, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 겔제 또는 에어로졸제 등의 피부외용제의 형태로 사용될 수 있다.
[0040] 또한 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경구제, 로션제, 리니멘트제,파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 가질 수 있다. 예컨대, 해당 부위에 국부적으로 사용되는 피부외용제인경우에는 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다. 해당 기술 분야에 알려진적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
[0041] 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose),락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제,좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기성분들은 유효성분, 즉 애기땅빈대 분획물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 [0042] 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을의미한다.
[0043] 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[0044] 본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
[0045] 또한 본 발명은 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염용 식품 조성물을 제공한다.
[0046] 본 발명의 갯지렁이 추출물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다.
[0047] 상기 갯지렁이 추출물이 식품 첨가제로 사용할 경우, 갯지렁이 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
[0048] 또한 상기 갯지렁이 추출물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있음은 물론이다.
[0049] 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 갯지렁이 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
[0050] 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 갯지렁이 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
[0051] 본 발명의 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10중량%, 바람직하게는 0.01~0.1중량%로 포함된다.
[0052] 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01~0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 [0053] 경우, 본 발명의 식품 조성물은안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 장기간 복용이 가능하다.
[0054] 또한 본 발명은 갯지렁이 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
[0055] 즉, 본 발명의 갯지렁이 추출물은 가축에 급여되는 사료에 첨가되는 첨가제 성분으로 사용될 수 있다.
[0056] 상기 사료는 가축에 급여되는 일반적인 사료로, 용어 "가축"은 집에서 기르는 짐승, 즉 포유류, 가금류 등을 의미하는 것이다. 본 발명에서 상기 포유류는 소, 돼지, 염소, 양, 말 등을 예로 들 수 있으며, 가금류로는 닭,오리, 칠면조 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[0057] 상기 사료 조성물은 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다.
[0058] 구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있다.
[0059] 상기 전분 함유 물질은 그것이 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 모두 사육동물의 기초사료에 포함될 수 있는데, 이러한 전분 함유 물질은 일반적으로 옥수수, 콩, 밀, 수수, 보리, 귀리 등으로부터 얻어진다. 적합한 전분 함유 물질로서는 옥수수 분쇄물이나 분말, 귀리 분쇄물이나 분말, 콩 분쇄물이나 분말, 밀 분쇄물이나 분말등을 들 수 있다. 바람직한 적합한 전분 함유 물질은 귀리 분말, 옥수수 분쇄물, 밀 분쇄물, 콩 분말 등이다.
이러한 전분 함유 물질은 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있다면, 그 농도는 특별히 제한되지 않는다.
일반적으로 전분 함유 물질은 약 30~80중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
[0060] 단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 유지시킬 수 있는 한, 가축의 기초사료에 포함될 수 있다. 경제적인 이유로 어분, 콩 분말 등과 같은 단백질 함유 물질이 사용되고 있는데, 다른 것들로서는 콩 단백질 농축물, 혈분,혈장 단백질, 탈지유 건체물, 유(乳) 단백질 농축물, 옥수수 글루텐(Gluten) 분말, 밀 글루텐 분말, 이스트, 해바라기씨 분말 등을 들 수 있다. 바람직한 단백질 함유 물질은 어분, 혈분, 혈장 단백질, 콩 분말 등이다. 단백질 함유 물질도 사육동물의 성장을 효과적으로 유지할 수 있는 한, 사육동물의 기초사료에 포함되는 그것의 농도는 중요하지 않다. 일반적으로, 단백질 함유 물질은 약 10~50중량%의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
[0061] 상기 지방 함유 물질로는 라드(Lard), 우지, 콩기름, 레시틴, 코코넛유 등을 포함하나, 이에 한정되지는않는다. 지방 함유 물질 또한 사육동물의 성장을 유지할 수 있는 한 그 농도는 제한되지 않으며, 일반적으로 약2~20중량의 범위로 기초사료에 포함될 수 있다.
[0062] 또한 기초사료에는 수용성, 지용성 비타민과 미량의 무기물이 포함될 수 있다. 상기 비타민으로는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 리보플라빈, 판토텐산(Pantothenic Acid), 나이아신, 비타민 B12, 엽산, 비오틴,비타민 C 등이 사용될 수 있다. 미량의 무기물로서는 구리, 아연, 요오드, 셀렌, 망간, 철, 코발트 등이 사용될수 있다. 여기서 "미량"이 의미하는 바는 가축의 기초사료에 사용된 이들 성분들의 양이 다른 성분들의 양보다실질적으로 적은 것을 의미한다. 일반적으로, 비타민이나 무기질이 미량으로 기초사료에 포함될 경우에 조성물총 중량에 약 0.0001~5중량%로 포함될 수 있다.
[0063] 또한 기초사료에는 BHT(Butylated Hydroxytoluene), BHA(Butylated Hydroxyanisole), 비타민 E, 아스코르브산등의 산화방지물질이 포함될 수 있으며, 이들 산화방지물질은 약 0.0001~1중량%의 극소량으로 포함될 수 있다.
[0064] 이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[0065] 이하 실시예 및 실험에 사용되는 시약 및 기기는 다음과 같다. 배양액에 사용하는 Dulbecco's modified Eagle'smedium(DMEM) 배지와 heat-inactivated Fetal bovine serum(FBS)는 Gibco BRL(Gaithersburg, MD, USA),Antibiotics(penicillin G와 streptomycin) 용액은 Hyclone(Logan, UT) 제품을 구입해 사용하였다. 항산화 분석에 사용되는 SOD kit는 trevigen(Gaithersburg, MD, USA), GSH-Px ki 는 Oxis International,Inc.(Forster, CA, USA)에서 구입해 사용하였다. 염증억제 관련 분석 시 사용되는 IL-1β와 TNF-α의 ELISA 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Western 분석 시 사용되는 ECL Plus kit는 AmershamBiosciences(Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 시약들은 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 Western 분석에 사용되는 모든 장비는 Bio Rad(Hercules, CA, USA) 제품을 사용하였고, ELISA microplate reader는 Biotech(USA), UV-visible spectrophotometer는Shimadzu(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
[0066] 실시예 1. 갯지렁이 추출물 제조
[0067] 갯지렁이는 블루오션피아㈜에서 판매하는 청갯지렁이(Perinereis Linea)를 구매하여 실험에 공시하였다. 청갯지렁이는 인하대학교의 홍재상교수가 검증한 후 실험에 사용하였고, 표준품은 전북대학교 치의학 전문대학원 치과약리학교실에 보관하였다. 갯지렁이는 해수에서 4~8회 세척을 통해 이물질을 제거한 후 초저온 냉동고(deepfreezer)에 24시간 동안 보관한 후 동결건조기(Ilshin Rab Co., Ltd.)를 사용하여 동결건조 하였으며, 동결건조된 갯지렁이를 믹서를 이용하여 분말을 제조하였다.

[0068] 상기 갯지렁이 분말 3g을 70%(v/v) 에탄올 30ml에 녹여 24시간 동안 실온에 방치한 후 상층액을 회수하여 370×g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액만을 분리하였다. 분리된 상층액은 다시 초저온 냉동고에서 24시간 동안보관한 후 동결건조기를 이용하여 동결건조하였다. 이어서, 동결건조된 추출물을 증류수 5ml에 녹인 후 4℃에서2,290×g, 5분 동안 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 회수된 상층액은 0.45㎛ 필터를 이용하여 여과한 후실험에 사용하기 전까지 초저온 냉동고에서 보관하였다.
[0069] 비교예 1. 지렁이 추출물 제조
[0070] 일반지렁이는 어벙이 낚시(대구)에서 판매하는 일반지렁이(Eisenia andrei)를 구입하여 실험에 공시하였고, 일반지렁이는 전북대학교의 홍용박사가 검증한 후 실험에 사용하였고, 표준품은 전북대학교 치의학 전문대학원 치과약리학교실에 보관하였다. 지렁이의 분말은 증류수를 이용하여 4~8회 세척을 통해 이물질을 제거 후 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물 제조와 동일한 방법으로 분말화한 후 추출하여 지렁이 추출물을 제조하였다.
[0071] 실험예 1. 세포 생존율 측정
[0072] 1-1. 대식세포의 세포배양
[0073] 쥐의 대식세포 Raw264.7 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구매하여 실험에공시되었다. 대식세포의 세포배양은 세포 배양액 DMEM에 10% FBS와 antibiotics(100units/ml penicillin G and100㎍/ml streptomycin)를 첨가하여 37℃, 5% CO2, 95% 습도 조건하에서 배양하였다. 대식세포는 염증을 유발하기 위해 LPS(2㎍/ml)을 FBS가 없는 배양액에 첨가하여 염증을 유도하였다.
[0074] 1-2. 세포 생존율 측정
[0075] 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해 MTT 분석 방법을 사용하여 생존율을측정하였다.
먼저 RAW264.7 세포를 96 well plate에 5×103

[0076] cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 1의갯지렁이 추출물을 2.5, 5, 10㎍/ml의 농도로 처리하였다. 이어서 PBS에서 세척하고 배양액에 MTT(3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) 100㎍/ml를 가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
세포는 다시 PBS로 세척한 후 200μl의 DMSO를 첨가하여 녹인 후 ELISA microplate reader로 540㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다. 세포 생존율은 대조구에 대한 백분율로 표시하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
[0077] 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물은 각각의 처리 농도에서 대조군과 비교하여 세포내 독성이 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, 갯지렁이 추출물은 세포 내 독성이 없는 것으로 판단되었으며, 이에 이후 실험에서 갯지렁이 추출물의 적정 농도를 2.5, 5, 10㎍/ml로 판단하여 실험을 진행하였다.
[0078] 실험예 2. 질산과산화 억제
[0079] 질산과산화가 세포 내 손상 기전을 잘 나타내 주기 때문에 MDA 측정방법을 사용하여 질산과산화 억제 효과를 측정하였다.
[0080] LPS을 처리하여 염증을 유도한 후 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물의 질산과산화 억제 효과를 알아보기 위해각각 2.5~10㎍/ml 농도를 처리하여 질산과산화 억제 효과를 측정하였다. 상기 갯지렁이 추출물이 처리된 세포는10%(w/v) TBA을 2배로 섞어 침전시켰다. 표준곡선은 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 재료인 말론디알데하이드 비스디메틸아세탈(malondialdehyde bisdimethylacetal)을 사용하여 준비하였다. 12,000×g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액은 1시간 동안 끓는 물에서 0.67%(w/v) TBA를 동일한 양으로 첨가하여반응시켰다. MDA 측정은 ELISA microplate reader로 532㎚에서 흡광도를 측정하여 MDA의 농도를 측정하고, 그결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, LPS 처리군(130.7±0.86)과 비교하여 실시예 1의 갯지렁이 [0081] 추출물을 처리한 군(124.9±1.17에서 117.2±0.65)에서는 농도 의존적으로 MDA가 유의적 감소함을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 특히, 갯지렁이 추출물 10㎍/ml 농도에서 높은 억제 효과를 나타내었다. 질산과산화는 외부의 강력한 자극이나 상처에의해 발생되며, 특히 LPS의 처리에 의한 질산과산화의 증가는 세포 손상과 항산화 물질의 감소를 초래한다. 따라서, 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물은 LPS에 의한 질산과산화의 생성을 억제할 수 있을 것임을 알 수있었다.
[0082] 실험예 3. 항산화 효소 활성효과
[0083] 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물과 비교예 1의 지렁이 추출물의 항산화 효소 활성 정도를 측정하기 위해 LPS처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물을 첨가하여 catalase 및 SOD를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
[0084] 3-1. Catalase 활성
[0085] Catalase 활성은 Aebi H 등의 방법을 사용하여 측정하였다. 먼저, 반응은 최종 양이 1ml이 되게 전체 세포 단백질 100㎍에 100mM KH2PO4(pH 7.0) 850μl, 19mMH2O2 150μl를 첨가하여 반응을 유도하였다. 4분 동안 10초 간격으로 25℃에서 흡광도(240㎚)를 측정하였다. Catalase의 specific activity는 하기 수학식 1에 의해계산하였다.
[0086] [수학식 1]
[0087] units/㎎ of protein/min = ΔA240㎚(1min) × 1000/43.6 × ㎎ protein.
[0088] 3-2. SOD 활성
[0089] SOD 활성은 SOD assay kit(Oxis Research, Portland, OR USA)를 사용하여 측정하였다. 보릭산과 디에틸렌디아민테트라 아세트산(DTPA)이 들어있는 2-아미노-2메틸-1,3-프로파네디올(2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, pH8.0)액 900μl, 40μl의 단백질 시료(0.1~0.5㎎) 및 1-메틸-2-비닐피리디늄 트리플루오로메탄설포네이트(1-methyl-2-vinylpyridium trifluoromethanesulfonate)액 30μl를 1ml cuvette에 넣고 섞은 후 1분 동안 37℃에두었다가 DPTA와 에탄올이 들어있는 5,6,6a,11b-tetrahydro-3,9,10-trihydroxybenzo[c]fluorine액 30μl를 첨가한 후, 525㎚에서 흡광도의 변화를 5분간 측정하였다.
[0091] 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, Catalase 활성은 LPS 처리구(47.04±0.92units/㎎)가 대조구(43.0±1.9units/㎎)에 비해 유의적으로 증가하였으나(P < 0.05), 비교예 1의 지렁이 추출물은 LPS 처리구와 비교하여 5 및 10㎍/ml(58.2±6.4, 71.2±3.3units/㎎)의 농도에서 각각 유의적으로 높은 활성도를 나타내었으며(P < 0.05), 본발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물 또한 5 및 10㎍/ml(72.7±3.0, 77.6±4.8units/㎎)의 농도에서 유의적으로높은 활성도를 나타내었다(P < 0.05).
[0092] SOD 활성은 LPS 처리구(7.76±0.31units/㎎)가 대조구(6.01±0.28units/㎎)에 비해 유의적으로 증가하였으나(P< 0.05), 비교예 1의 지렁이 추출물에서 LPS 처리구와 비교하여 5 및 10㎍/ml(9.51±0.07,9.64±0.20units/㎎)의 농도에서 각각 유의적으로 더 높은 활성도를 나타내었으며(P < 0.05), 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물 또한 LPS 처리구와 비교하여 2.5, 5 및 10㎍/ml(9.96±0.23, 11.05±0.23, 13.19±0.99units/㎎)의 농도에서 각각 유의적으로 더 높은 활성도를 나타내었다(P < 0.05). 특히, 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물(10㎍/ml)은 지렁이 추출물(10㎍/ml)과 비교하여 유의적으로 높은 활성도를 나타내었다(P <0.05).상기와 같은 결과로부터, LPS에 의한 산화 스트레스에 대한 갯지렁이 추출물은

[0093] 항산화 효과가 우수하게 나타났으며, 따라서 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물이 강력한 항산화제로 사용 가능할 것으로 판단되었다.
[0094] 실험예 4. COX-2iNOS 단백질 발현에 미치는 영향
[0095] iNOS의 증가에 의한 NO의 과도한 생성과 COX-2의 증가는 염증반응의 특징이다. 따라서 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물과 비교예 1의 지렁이 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 마우스의 COX-2 및 iNOS의 발현에 미치는영향을 알아보았다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

[0096] 전기영동을 위한 단백질 시료의 추출은 처리 시간별로 세포를 ice-cold PBS으로 3회 세척한 후, lysisbuffer[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 137mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 1mMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF) 및 1×protease inhibitor cocktail]를 넣어 4℃에서 30분간 반응시키고16,000×g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 이후, 동일한 양의 단백질을 8~10% SDS-PAGE로 분리시킨후, 단백질을 polyvinylidene difluoride(PVDF) 막(Bio-Rad)으로 transfer하였다. 이 막을 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer(5% non-fat milk와 0.1% Tween 20을 함유한 TBS 용액)에서 1시간 동안반응시킨 후, 각각의 단백질에 대한 항체(anti-iNOS, anti-COX2)를 가하여 1~2시간 동안 반응시켰다. 이어서.1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, 2차 항체로 반응시켰다. 이어서 ECL Pluskit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 반응시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay 방법을 사용하여 595㎚에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
[0097] 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, iNOS 결과에서는 LPS 처리구의 경우 대조구에 비해 8배 정도 증가하였으나,지렁이와 갯지렁이 추출물 처리구는 각각 4배 및 8배 정도가 유의적으로 감소되었다(P < 0.05). 또한 본 발명의유효성분인 갯지렁이 추출물은 지렁이 추출물과 비교해 유의적으로 3배 정도 더 감소되는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(P < 0.05).
[0098] COX-2의 결과에서는, 도 3A 및 3C에 나타낸 바와 같이 LPS 처리구에 비해 갯지렁이 추출물 처리구가 유의적으로2배 정도 감소되었으나(P < 0.05), 지렁이 추출물 처리구는 감소하지 않고 오히려 더 증가함을 확인할 수 있었다.
[0099] 염증반응에 의한 iNOS와 NO, COX-2의 증가는 만성 염증질환을 야기하며, 염증인자의 억제는 염증관련 질병 치료에 중요하게 인식되고 있다. 이상의 실험결과에서 지렁이 추출물의 경우 COX-2에서 LPS 처리구에 비해 오히려더 증가되는 결과를 보였다. COX-2의 염증대사 경로는 COX-2의 증가에 따라 prostaglandin E2의 활성이 유도되며, 최종적으로 염증반응이 일어나게 되기 때문에 iNOS의 증가에 따른 NO의 활성과는 다른 경로를 따른다. 따라서, 지렁이의 경우 일부 경로에 의한 염증 억제 활성만을 가지고 있으며, 이에 따라 염증 억제에 대한 한계점을갖는 것을 확인할 수 있었다.
[0100] 그러나, 본 발명의 유효성분인 갯지렁이 추출물은 지렁이 추출물과 비교해 iNOS와 COX-2의 억제 효율이 더 높게나타났으며, 염증반응이 일어나는 iNOS, NO 경로뿐 아니라, COX-2 경로를 모두 억제할 수 있음을 확인하였다.
이같은 결과는 갯지렁이 추출물이 일반지렁이와 비교하여 더 높은 항염증 효능을 나타내는 것으로, 본 발명의유효성분인 갯지렁이 추출물을 항염증 제제로 활용 가능할 것임을 예측할 수 있었다.
[0101] 실험예 5. IL-1β의 억제에 미치는 영향
[0102] IL-1β는 염증반응에 의해 생산된다. 따라서 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물과 비교예 1의 지렁이 추출물의염증억제 정도를 측정하기 위해 LPS 처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물을 첨가하여 IL-1β를 측정하였다.
[0103] 먼저, 세포 배양액 내의 IL-1β의 양을 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)를 수행하였다. 대식세포를 1×106cells/well로 현탁하고, 2.5, 5, 10㎍/ml의 농도로 상기 실시예 1의 갯지렁이 추출물과비교예 1의 지렁이 추출물을 전처리하고, 30분 뒤에 LPS(2㎍/ml)로 자극하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서세포 상층액을 수집하여 IL-1β를 ELISA 방법으로 정량하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
IL-1β의 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 갯지렁이 추출물은 LPS 처리구(125.4±5.0)[0104] 에 비해 5, 10㎍/ml(97.11±3.3, 84.89±7.8) 농도에서 유의적으로 높은 억제 효과를 나타내었으나(P < 0.05), 지렁이 추출물은 LPS 처리구와 비교해 오히려 더 증가하는 경향을 보였다.
[0105] 실시예 2. 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물 제조
[0106] 펩티도글리칸(Micrococcus luteus, Sigma 53243)을 증류수 30ml에 희석하여 상기 실시예 1에서 보관된 갯지렁이의 채강 내 3 부위에 각 마리당 10ppm씩 주입하였다. 펩티도글리칸이 주입된 갯지렁이는 10시간 동안 활성화시킨 후, 실험실로 옮겨 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분말화한 후 추출하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 제조하였다.
[0107] 실험예 6. 세포 생존율 측정
[0108] 상기 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 세포 생존율을 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
[0109] 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물 각각의 처리 농도에서 대조군과 비교하여 세포 내 독성이 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물은 세포 내 독성이 없는 것으로 판단되었으며, 이에 이후 실험에서 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 적정농도를 2.5, 5 그리고 10㎍/ml로 판단하여 실험을 진행하였다.
[0110] 실험예 7. 질산과산화 억제
[0111] LPS 처리 후 상기 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 질산과산화 억제 효과를 알아보기 위해상기 실험예 2와 동일한 방법으로 실험하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[0112] 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유효성분인 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물은 LPS 처리군(130.7±1.5)과 비교하여 10㎍/ml의 농도(104.5±4.4)에서 유의적으로 낮은 MDA 활성을 나타내었다(P <0.05). 따라서, 본 발명의 유효성분인 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물은 LPS에 의한 질산과산화의 생성을억제할 수 있을 것임을 알 수 있었다.
[0113] 실험예 8. 항산화 효소 활성효과
[0114] 상기 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 항산화 효소 활성 정도를 상기 실험예 3과 동일한방법으로 catalase, SOD 및 GSH-Px를 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[0116] 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, SOD 및 GSH-px 활성은 LPS 처리구가 대조구에 비해 유의적으로 증가하였지만(P< 0.05), 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물은 LPS 처리구와 비교하여 catalase 및 SOD의 활성이 2.5, 5, 및10㎍/ml의 농도에서 각각 유의적으로 높은 활성도를 나타내었으며(P < 0.05), GSH-px 활성에서는 5 및 10㎍/ml의 농도에서 유의적으로 높은 활성도를 나타내었다(P < 0.05). 또한 SOD 및 GSH-px 활성의 경우 10㎍/ml의 농도에서 유의적으로 가장 높은 활성도를 나타내었다(P < 0.05).
[0117] 즉, 본 발명의 유효성분인 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물이 LPS 처리군과 대비하여 유의적으로 높은 항산화 효율을 나타냈으며, 특히 10㎍/ml의 농도의 경우 MDA 억제 효능과 SOD 및 GSH-px 활성 정도가 가장 높게증가된 결과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따라 펩티도글리칸에 의한 면역을 유도한 갯지렁이 추출물은 항산화 효율을 증진시킬 것으로 판단되었다.
실험예 9. NO 생성과 [0118] iNOS 단백질 발현에 미치는 영향
[0119] 상기 실시예 2의 갯지렁이 추출물이 LPS에 의해 유도된 COX-2, iNOS와 NO의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 실험하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
[0120] 도 7B에 나타낸 바와 같이, LPS에 의한 염증이 유도된 iNOS의 결과 LPS 처리구는 대조구에 비해 20배 증가하였지만 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물은 LPS와 비교해 2.5~10㎍/ml의 농도에서 iNOS가 1.5~2.5배 정도 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 또한 도 7C에 나타낸 COX-2의 결과, LPS 처리구에 비해 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물 처리구에서는 2.5~10㎍/ml 농도에서 iNOS가 2~3배 정도 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 도 7D에 나타낸 NO 생산 결과에서는, LPS 처리구와 비교하여 펩티도글리칸처리된 갯지렁이 추출물 처리구에서는 5~10㎍/ml의 농도에서 iNOS가 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(P <0.05). 이같은 결과로부터, 본 발명의 유효성분인 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 염증 억제는 5~10㎍/ml의 농도에서 억제됨을 확인할 수 있었고, 펩티도글리칸에 의한 면역을 유도한 갯지렁이 추출물은 항염증향상을 가져올 수 있다고 판단되었다.
[0121] 실험예 10. IL-1α와 TNF-α의 억제에 미치는 영향
[0122] 상기 실시예 2의 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물의 염증억제 정도를 측정하기 위하여, 상기 실험예 5와동일한 방법으로 LPS 처리 후 지렁이와 갯지렁이 추출물을 첨가하여 IL-1α와 TNF-α를 측정하고, 그 결과를 도8에 나타내었다.
[0123] 도 8A에 나타낸 바와 같이, IL-1β의 결과에서 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물 처리구는 LPS 처리구에 비해 5㎍/ml의 농도에서 유의적으로 높은 억제 효과를 나타내었다(P < 0.05). 또한 도 8B에 나타낸 TNF-α의 결과에서는, LPS 처리구와 비교하여 펩티도글리칸 처리된 갯지렁이 추출물 처리구는 2.5, 5, 10㎍/ml의 농도에서 유의적으로 낮은 TNF-α의 발현 정도를 나타내었다(P < 0.05). 이같은 결과로부터, 본 발명의 유효성분인 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물은 높은 염증억제 효율을 나타내며, 펩티도글리칸의 처리에 의해 갯지렁이 추출물의 염증억제 효과가 증가된다고 판단되었다.
[0124] 제제예 1. 화장료 제제의 제조
[0125] 유연화장수 제조-1
[0126] 갯지렁이 추출물 0.1중량%, 1,3-부틸렌글리콜 5.2중량%, 올레일알코올 1.5중량%, 에탄올 3.2중량%, 폴리솔베이트 20 3.2중량%, 벤조페논-9 2.0중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 글리세린 3.5중량%, 미량의 향, 미량의방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 유연화장수를 제조하였다.
[0127] 유연화장수 제조-2
[0128] 상기 유연화장수 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0129] 밀크로션 제조-1
[0130] 갯지렁이 추출물 0.1중량%, 글리세린 5.1중량%, 프로필렌글리콜 4.2중량%, 토코페릴아세테이트 3.0중량%, 유동파라핀 4.6중량%, 트리에탄올아민 1.0중량%, 스쿠알란 3.1중량%, 마카다미아너트오일 2.5중량%, 폴리솔베이트60 1.6중량%, 솔비탄세스퀴롤레이트 1.6중량%, 프로필파라벤 0.6중량%, 카르복실비닐폴리머 1.5중량%, 미량의향, 미량의 방부제, 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 밀크로션을 제조하였다.
[0131] 밀크로션 제조-2
[0132] 상기 밀크로션 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0133] 영양크림 제조-1
[0134] 갯지렁이 추출물 0.5중량%, 글리세린 4.0중량%, 바셀린 3.5중량%, 트리에탄올아민 2.1중량%, 유동파라핀 5.3중량%, 스쿠알란 3.0중량%, 밀납 2.6중량%, 토코페릴아세테이트 5.4중량%, 폴리솔베이트 60 3.2중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 3.1중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여통상의 방법으로 영양크림을 제조하였다.
[0135] 영양크림 제조-2
[0136] 상기 영양크림 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0137] 마사지크림 제조-1
[0138] 갯지렁이 추출물 0.5중량%, 글리세린 4.0중량%, 바셀린 3.5중량%, 트리에탄올아민 0.5중량%, 유동파라핀 24.0중량%, 스쿠알란 3.0중량%, 밀납 2.1중량%, 토코페릴아세테이트 0.1중량%, 폴리솔베이트 60 2.4중량%, 카르복실비닐폴리머 1.0중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 2.3중량%, 미량의 향, 미량의 방부제 및 잔량의 정제수를 혼합하여통상의 방법으로 마사지크림을 제조하였다.
[0139] 마사지크림 제조-2
[0140] 상기 마사지크림 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다. 잔량의 정제수를 혼합하여 통상의 방법으로 마사지크림을제조하였다.
[0141] 세정용 바디클렌저 제조-1
[0142] 갯지렁이 추출물 1g, 음이온계면활성제 18g, 비이온계면활성제 5g, 글리세린 7g, 소듐클로라이드 3g, 천연올리브액상비누 1.5g, 향료 1g 및 물 100g을 혼합하여 통상의 방법으로 세정용 바디클렌저를 제조하였다.
[0143] 세정용 바디클렌저 제조-2
[0144] 상기 바디클렌저 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0145] 제제예 2. 약학 제제의 제조
[0146] 산제 제조-1
[0147] 갯지렁이 추출물 20㎎, 유당 100㎎ 및 탈트 10㎎을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
[0148] 산제 제조-2
[0149] 상기 산제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0150] 정제 제조-1
[0151] 갯지렁이 추출물 10㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 정제의제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
[0152] 정제 제조-2
[0153] 상기 정제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0154] 캡슐제 제조-1
[0155] 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 갯지렁이 추출물 10㎎, 결정성 셀룰로오스 3㎎, 락토오스 14.8㎎ 및 마그네슘스테아레이트 0.2㎎을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
[0156] 캡슐제 제조-2
[0157] 상기 캡슐제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0158] 주사제 제조-1
[0159] 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 갯지렁이 추출물 10㎎, 만니톨 180㎎, 주사용 멸균 증류수2,974㎎ 및 Na2HPO4· 2H2O 26㎎으로 제조하였다.
[0160] 주사제 제조-2
[0161] 상기 주사제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0162] 액제 제조-1
[0163] 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 갯지렁이 추출물 20㎎, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 더 가하여 전체 100mL로 조절한 후갈색병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
[0164] 액제 제조-2
[0165] 상기 액제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0166] 제제예 3. 식품 제제의 제조
[0167] 건강식품 제조-1
[0168] 갯지렁이 추출물 100㎎, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70g, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2g, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10g, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산50g, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎ 및 염화마그네슘 24.8㎎을 혼합한 다음,과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다. 이때, 상기 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도무방하다.
[0169] 건강식품 제조-2
[0170] 상기 건강식품 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0171] 건강음료 제조-1
[0172] 통상의 건강음료 제조방법에 따라 갯지렁이 추출물 100㎎, 비타민 C 15g, 비타민 E(분말) 100g, 젖산철 19.75g,산화아연 3.5g, 니코틴산아미드 3.5g, 비타민 A 0.2g, 비타민 B1 0.25g, 비타민 B2 0.3g 및 정량의 물을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉멸균한 뒤 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다. 이때, 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
[0173] 건강음료 제조-2
[0174] 상기 건강음료 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0175] 제제예 4. 사료 제제의 제조
[0176] 사료첨가제 제조-1
[0177] 갯지렁이 추출물 100g 및 적량의 부형제를 혼합하여 통상의 사료첨가제의 제조방법에 따라 각각 제조하였다.
[0178] 사료첨가제 제조-2
[0179] 상기 사료첨가제 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0180] 사료 제조-1
[0181] 갯지렁이 추출물 50g, 버섯배지 200g, 소맥피30g, 비트펄프 50g, 쌀주정박 220g, 옥수수후레이크 200g, 전지대두 40g, 전분박 100g, 콘싸일리지 200g, 옥수수속대 180g, 비지 400g, 라이그라스 323g, 지오라이트 14g 및 타피오카 40g을 혼합하여 통상의 사료 제조방법에 따라 각각 제조하였다.
[0182] 사료 제조-2
[0183] 상기 사료 제조 시 갯지렁이 추출물을 대신하여 펩티도글리칸이 처리된 갯지렁이 추출물을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실시하였다.
[0184] 비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나변형을 포함한다.