해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 해당화(Rosa rugosa) 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 사료조성물에 관한 것이다. 본 발명은 IL-6에 의해 유도되는 신호전달체계를 저해하고, 파골세포 분화를 억제함으로써 IL-6 매개성 질환, 예컨대, 골 대사성 질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있으며, 특히, 다른 부위의 추출물과 달리 세포독성이 없고, 오랫동안 식품으로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없이 상기 질환의 치료에 이용될 수 있는 이점이 있다.

청구범위
청구항 1
해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 2
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 수득되는 것인, 약학적 조성물.
청구항 3
제2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올인 것인, 약학적 조성물.
청구항 4
제1항에 있어서, 상기 추출물이 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)의 활성을 저해하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 5
제1항에 있어서, 상기 IL-6 매개성 질환은 골 대사성 질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염인 것인 조성물.
청구항 6
제5항에 있어서, 상기 골 대사성 질환은 골다공증인 것인 조성물.
청구항 7
제5항에 있어서, 상기 조성물이 파골세포 분화를 억제시키는 것인, 약학적 조성물.
청구항 8
제1항의 조성물을 인간을 제외한 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 (interleukin-6) 매개성 질환의 치료방법.
청구항 9
해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물.
청구항 10
해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
청구항 11
해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 (interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 개선용사료조성물.
청구항 12
해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 (interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 개선용 음용수 첨가제.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 해당화(Rosa rugosa) 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-[0001] 6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6매개성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료조성물 및 음용수첨가제에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 인터류킨-6(IL-6)는 B 세포 자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2(INF-β2)로도 불리는 사이토카인으로, B 임파구의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었다(Nature 1986, 324, 73-76). IL-6는 세포막 위 두 종류의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달하는데, 그 중 하나는 IL-6가 결합하는 단백질인 IL-6 수용체로, 세포막을관통하여 발현되어있는 분자량 약 80kD의 막결합형 단백질이다. 다른 하나는, 비리간드 결합성의 시그널(signal) 전달에 속하는 분자량 약 130kD의 막단백질인 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합한다(J. Exp. Med 1987, 166, 967). 리간드와 수용체들이 결합하면, 세포내에서는 Janus Kinases 2(JAK2)가 인산전이반응(transphosphorylation)에 의해 활성화된다. 또한, 상기 활성화된 JAK2에 의해 수용체 세포질 도메인의 여러 타이로신 잔기(tyrosine residues)가 인산화(phosphorylation)되고, 이것은 SH2나 다른 인산 타이로신 결합 모티프(phosphotyrosine binding motif)를 가지고 있는STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)와 같은 세포질 내 단백질의 도킹사이트(docking site) 역할을 한다. 수용체의 세포질 도메인에 결합한 STAT3는 JAK2에 의해 인산화(phosphorylation)가 된 후, 수용체에서 떨어져 나온다. 활성화된 STAT3들은 세포질 내에 서로서로 결합하여 호모(homo-) 또는헤테로다이머(heterodimer)를 이룬 후, 핵 내로 들어가 목적 유전자의 인식서열(recognition sequence)에 결합하여 전사를 증가시킨다(Nat Rev Mol Cell Biol 2002, 3, 651-62, Science 1997, 277, 1630-1635).
[0003] STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)는 류마티스성 관절염을 포함한 자가면역질환또는 골다공증에서 NF-κB와는 또 다른 하나의 중요한 전사인자로의 역할을 하는 점이 알려져 있다. 특히,STAT3는 사이토카인인 IL-6에 의해 활성화된다고 잘 알려져 있으며, 표피 성장인자(Epidermal growth factor,EGF)도 IL-6에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 최근, 골다공증과 IL-6와의 연관성에 대한 연구결과가 많이 보고되고 있는데, 특히, IL-6에 의해 유도되는 STAT3 활성이 파골세포 분화와 뼈 생성에 중요한 역할을 한다는 것이 동물모델을 통해 입증되었으며(Bone 2006, 39, 505-512), STAT3 결핍 마우스(STAT3-deficient mice)의 경우골밀도 및 골부피가 감소되고, 골다공증에 부정적인 영향을 미치는 파골세포 수가 증가되는 점이 관찰된 바 있다(BBRC 2005, 328, 800-807). 반면, IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 인산화를 저해하는 화합물인 매딘돌린A(madindoline A)를 폐경기 골다공증 실험을 위한 동물모델인 OVX 마우스에 처리하면 뼈의 재흡수를 저해하고(PNAS, 2002, 99(23), 14728-14733), 에스트로젠 결핍 골다공증 모델에서는 IL-6에 의한 파골세포 분화가 골수세포로부터 증가되며(Science, 1992, 257, 88-91), IL-6-/- 마우스 모델에서는 에스트로겐 고갈에 따른 뼈 손실과 파골세포의 전구체 수 증가 등의 변화가 나타나지 않음도 보고되었다(EMBO J 1994, 13, 1189-1196). 상기와같은 사실은 IL-6가 특히, STAT3의 인산화를 통하여 뼈의 형성 및 재흡수에 중요하게 작용함을 나타내는것이다.
이와 관련하여, IL-6에 의해 유도되는 신호전달체계와 골다공증과 같은 골 대사성 [0004] 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역질환과의 관련성에 대하여 다양한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 특히, IL-6의 신호전달체계 억제에 대하여 항 IL-6 R 항체(anti-IL-6 receptor antibody)를 이용한 것이 가장 많이 알려져 있다. 구체적으로는, 항IL-6 R 항체를 이용한 류마티스성 관절염에 대한 활액 세포 성장 억제제(국제특허공개 제96/011020호), 항 IL-6R 항체를 이용한 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 류마티스성 관절염, 목축업자 질병 및 맥관증식신염과 같은 IL-6 산물에 기인하는 질병의 치료 등이 이미 알려진 바 있다(국제공개특허 제96/012503호). 또한, 항 IL-6 R 항체가 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연성 과민증 및 아토피성피부염과 같은 민감성 T 세포 관련 질병(국제특허공개공보 제98/042377호), 전신성 에리테마토스의 치료, 크론병의 치료(국제특허공개공보 제99/047170호), 췌장염의 치료(국제특허공개공보 제00/010607호), 건선의 치료(국제특허공개공보 제02/034292호) 및 연소성 만성 관절염의 치료(국제특허공개공보 제02/080969호)에 적용될 수있음도 보고되었다. 그러나 상기 항 IL-6 R 항체가 개체 내에 도입되는 경우에는 외래 단백질로서 인지될 수 있는 부분인 에피토프를 가질 수 있으므로, 치료제로서 사용될 경우 여전히 면역원성으로 작용하는 문제점이있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 면역체계에 인지되지 않는 단백질이 아닌 작은 분자 화합물(smallmolecule compound)을 이용하여 IL-6에 의해 매개되는 질병의 치료제를 개발하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다.
[0005] 한편, 해당화(Rosa rugosa Thunberg)는 장미과에 속하는 낙엽관목으로, roaamultin, quercetin, citric acid,malic acid, lycopene, tormentic acid, euacaphic acid, biaaborossol A 등의 다양한 성분을 함유하고, 꽃과열매는 관상용 및 향수의 원료나 약용으로 쓰인다. 특히, 5월에 막 피어난 꽃을 매괴화라 하여 토혈, 하리 월경불순, 이질 등의 치료에 쓰이고, 열매는 피로회복에, 뿌리는 당뇨병 치료의 민간요법에 사용되며(Namba (1994)he encyclopedia of Wakan-yaku(traditional Sino-Japanese Medicines) which color pictures Vol (II).
Hoikuaha, Tokyo. p.118), 최근에는 해당화 과육 및 종자 추출물이 골형성 관련 세포에 영향을 미친다는 점도보고된 바 있다(韓資植誌 23(2):157~164(2010) Korean J. Plant Res. (2010.04.16.)). 그러나 해당화의 과육및 종자 추출물은 세포독성을 가지고 있어 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 저해활성을 유도한다는 문제점이 여전히 남아있다.
[0006] 이러한 배경 하에, 본 발명자들은 IL-6에 의해 활성화되는 STAT3 경로를 표적으로 하여 IL-6 매개성 질환에 치료 효과가 있는 천연물을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 해당화 추출물 특히, 해당화 꽃 추출물이 세포독성을가지지 않고, IL-6에 의해 유도되는 전사인자인 STAT3의 전사활성 및 인산화를 저해하여 IL-6에 의하여 매개되는 신호전달처계를 효과적으로 저해시키며, 파골세포 분화를 저해하는 우수한 활성을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 내용
해결하려는 과제
[0007] 본 발명의 하나의 목적은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[0008] 본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6매개성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-[0009] 6 매개성 질환의 예방 또는 개선용식품 조성물을 제공하는 것이다.
[0010] 본 발명의 또 다른 목적은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
[0011] 본 발명의 또 다른 목적은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용사료조성물을 제공하는 것이다.
[0012] 본 발명의 또 다른 목적은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용음용수 첨가제를 제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
[0013] 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물의 용도를 제공한다.
[0014] 본 발명에서 용어, "해당화(Rosa rugosa Thunberg)"는 장미과 낙엽관목으로, roaamultin, quercetin, citricacid, malic acid, lycopene, tormentic acid, euacaphic acid, biaaborossol A 등의 다양한 성분을 함유하고,관상용 및 향수의 원료나, 토혈, 하리 월경불순, 이질, 피로회복, 또는 당뇨병 치료의 민간요법에서 사용된다고알려져 있다. 그러나 해당화 추출물, 특히, 해당화 꽃 추출물이 IL-6 매개성 질환, 구체적으로, 염증성 장질환,골다공증과 같은 골 대사성 질환, 또는 아토피 피부염의 치료 용도에 대해서는 알려진 바 없으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다. 본 발명에서 해당화는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
[0015] 본 발명에서 용어, "해당화 꽃 추출물"은 해당화 꽃에서 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 본 발명은 해당화여러 부위 중 해당화 꽃 추출물이 IL-6 매개 STAT3 루시퍼라제 저해활성에 현저한 효과가 있다는 것을 확인한것으로, 구체적으로는 해당화 열매 추출물과 비교하여 그 우수함을 확인하였다.
[0016] 상기 해당화 꽃 추출물은 건조 중량의 약 2 내지 20배, 구체적으로는, 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 또는 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 저급 알코올의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 구체적으로 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, IL-6 매개성 질환의 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 구체적으로는, 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 더 구체적으로는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한해당화 꽃 추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 IL-6 매개성 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있는한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는이들의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 상기 해당화 꽃 추출물은 천연, 잡종, 변종식물로부터 추출될수 있으며, 단독으로 또는 타 약학적 활성 추출물, 분획물 또는 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 분말화된 해당화 꽃에 에탄올 또는 물을 넣고 실온에서 추출하였다(실시예 1).
[0017] 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)의 활성을 저해하여, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
[0018] 본 발명에서 용어, "IL-6 매개성 질환"은 IL-6에 의한 신호전달경로가 활성화되어 발명하는 질환을 총칭하는 의미로서, 구체적으로, IL-6에 의하여 STAT3가 인산화되어 활성화됨에 따라 발병하는 질병을 의미한다. 본 발명의목적상 상기 IL-6 매개성 질환은 본 발명의 해당화 꽃 추출물에 의하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환이라면제한없이 포함하며, 그 예로 골 대사성 질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염일 수 있으나, 이에 제한되지않는다. 구체적으로, IL-6는 gp130, gp80과 같은 수용체에 결합하여, STAT3 단백질의 인산화를 가져오고, 이에의해 활성화된 STAT3 단백질은 핵 내로 들어가 표적 유전자를 발현시킴을 통하여 골 대사성 질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염의 발병 또는 진행을 가져올 수 있다.
본 발명에서 용어, "골 대사성 질환"에는 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 [0019] 골다공증, 류마티스성 관절염, 치주질환, 파제트병 및 전이성 암 등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함되나, IL-6에의한 신호전달경로가 활성화되어 발명하는 골 질환이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, “골다공증”은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 의미한다. 뼈는 인체 내 여러 기관들을 보호하고 칼슘과 같은 체내에 필요한 물질들을 보관하는 저장소로서 기능하며,뼈 조직에 존재하는 뼈를 분해하는 파골세포(Osteoclast) 및 뼈를 생성하는 조골세포(Osteoblast) 간의 균형에이어 항상성이 유지된다. 골다공증의 경우에는 두 세포 활성이 균형이 깨지게 되면서 파골세포에 의한 지나친뼈의 파괴가 일어나 발병 및 진행된다. 골다공증에서 주요한 분자로는 RANKL(Receptor activator of nuclearfactor kappa-B ligand)이 있으며, RANKL이 이의 수용체에 결합하여 다양한 전사인자를 활성화시켜 파골세포의분화를 촉진시키며, 특히, IL-6는 RANKL에 의해 매개되는 파골세포 분화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(KimK et al., J Immunol. 2007 May 1;178(9):5588-94.). 따라서, IL-6에 의해 활성화되는 신호전달을억제시키고, 파골세포의 분화를 억제시켜 파골세포에 의한 뼈의 파괴를 감소시킬 수 있는 물질의 경우 골다공증의 치료제로서 이용될 수 있다. 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제를 효과적으로 억제시키므로, 골다공증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있음이 확인되었다.

[0020] 본 발명에서 용어, "염증성 장질환(inflammatory Bowel Disease, IBD)"은 장 점막 세포에서 외부 미생물과 항원제시세포에 의해 CD4+ T 림파구의 비정상적인 활성화가 일어나고, 이에 따른 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-12, IL-17, IL-23, 및 IL-27)이 지속적으로 발현되어 유발되는 질병으로, 본 발명에서는 DSS 처리에 의해서 유도되는 염증성 장질환 동물모델에서 예방 또는 치료 효과를 확인하였다.
[0021] 본 발명에서 용어, "아토피 피부염"은 피부질환의 일종으로서, 피부의 부스럼, 습진, 간지러움을 동반하는 질병이다. 상기 아토피 피부염의 발병에는 환경적 요인 및 유전학적 요인 모두가 관여하는 것으로 알려져 있으나,정확한 발병기전은 규명되지 않았다. 상기 아토피 피부염은 케라틴 세포 또는 내피세포에서 유래한 단백질을 항원을 인식하고 면역 반응을 일으키는 증상을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기존에 보고된 바에 따르면, 아토피 피부염은 CD28에 대한 자가항체를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 CD28 자가항체는 T 세포의 활성화를 가져올 수 있을 뿐만 아니라 아토피 피부염과 다른 염증성 피부 질환과 구별할 수 있는 특징으로 제시된바 있다(Clin Exp Immunol. 2006 Nov;146(2):262-9.). 최근 아토피 피부염은 유소아 뿐만 아니라 성인에서도빈번하게 발병하여, 그 예방 또는 치료가 중요한 사회적인 문제가 되고 있으나 그 원인이 명확하며, 또한, 기존에 사용되고 있는 스테로이드 제제 등의 효과가 뛰어나지 않을 뿐만 아니라 부작용의 문제가 있어, 효과가 뛰어나면서도 유소아에도 사용가능한 안전한 아토피의 치료제의 개발이 요구되는 실정이다. 본 발명의 조성물은 천연물에서 유래된 것으로, 스테로이드 제제 등에 비하여 유소아에 적용하기 안전한 이점이 있고, 상기 조성물을이용하여 IL-6 매개 경로를 차단하고, IL-6 매개 신호전달경로에 의한 부종을 비롯한 아토피 피부염에 수반되는다양한 염증 현상을 완화시킴으로써, 아토피 피부염을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
[0022] 본 발명의 골 대사성 질환, 염증성 장질환 및 아토피 피부염은 IL-6에 의해 유발되는 것일 수 있다.
[0023] 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 파골세포의 분화를 억제하여, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 해당화 꽃 추출물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-Bligand)에 의해 유도되는 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.
[0024] 본 발명에서 용어, "파골세포"는 조혈세포에서 유래된 골 흡수에 관여하는 세포로서, 골의 재형성에서 중요한역할을 한다. 파골세포에 의한 골 흡수는 파골세포 전구체로의 분화, 융합에 의한 다핵성 파골세포의 형성, 및골 흡수를 위한 성숙한 파골세포의 활성화를 포함하는 여러 단계로 구성된다. 성숙한 다핵성 파골 유사 세포(OCL)는 골의 재흡수 동안에 정상적 액틴 세포골격구조, 파상의 가장자리, 및 산성 조건을 유지한다.
[0025] 본 발명에서 용어, "RANKL"은 receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand의 약어로, tumornecrosis factor ligand superfamily member 11(TNFSF11), TNF-related activation-inducedcytokine(TRANCE), osteoprotegerinligand(OPGL), 및 osteoclast differentiation factor(ODF)로도 알려져 있다. RANKL은 TNFSF11 유전자에 의해 코딩되는 인간 내의 단백질로, 타입 II의 막 단백질로, 종양괴사인자(tumornecrosis factor, TNF) 수퍼패밀리의 일 구성으로 알려져 있다.
[0026] 본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 약학적 [0027] 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제,현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 해당화 꽃 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는, 0.001 내지 1 중량% 포함될수 있다.
[0028] 상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨,에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트,탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함할 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 해당화 꽃 추출물을 포함하여 한가지 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이해당될 수 있는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
[0029] 본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
[0030] 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로는, 0.001 내지 500mg/kg이 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
[0031] 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 해당화의 꽃 에탄올 추출물과 물 추출물이 IL-6에 의해 유도되는 STAT3루시퍼라제 활성을 효과적으로 억제하여 해당화 열매 에탄올 추출물보다 현저하게 우수한 활성을 가지고(도 1),상기 해당화 꽃 추출물에서 나타나는 세포독성은 열매 추출물에 비해 세포독성이 현저히 낮음을 확인하였다(도2). 또한, 본 발명의 해당화 꽃 추출물이 파골세포 분화에 영향을 주는지 해당화 열매 추출물과 비교한 결과,해당화 꽃 에탄올 추출물은 60 및 30㎍/㎖ 농도에서 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 활성이우수한 반면, 해당화 열매 추출물에서는 그 효과가 미미함을 확인하였다(도 3).
[0032] 아울러, 해당화 꽃 추추물이 IL-6 매개성 질환에서 미치는 효과를 확인하였는데, 구체적으로, 염증성 골다공증마우스모델에 해당화 꽃 추출물을 투여하면 LPS 유도 그룹에서 낮아진 골밀도 및 골질량이 유의적으로 회복되었고(도 4), 염증성 장질환 마우스모델에 해당화 꽃 추출물을 투여하면(500mg/kg), DSS 처리에 의해 유도되는 IBD증상이 치료되며, 염증성사이토카인(IL-6, IL-17, IFN-g)도 효과적으로 억제됨을 확인하였다(도 5 및 6). 아토피 피부염의 경우, 상기 피부염의 유발 시 중요한 HaCaT 세포에서 1000 ㎍/㎖ 농도에서도 독성을 가지지 않았으며, 역시 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, CCL17을 억제하는 효과가 있었다(도 7 및 8).
특히, 해당화 물 추출물의 경우는 에탄올 추출물보다 염증성 사이토카인 억제 [0033] 효과가 매우 우수하고, 농도 의존적으로 저해하였으며(도 9), 100㎍/㎖ 농도에서 TNF-α/INF-γ에 의해 활성화되는 STAT1의 인산화 및 IκBα 분해 억제를 통해 NF-κB를 감소하는 효과가 있음도 확인되었다(도 10).
[0034] 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 IL-6 매개 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개 질환의 치료 방법을 제공한다.
[0035] 상기 조성물, IL-6 매개성 질환 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
[0036] 구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 IL-6 매개 질환 의심 개체 내에투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체
를 의미한, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하,복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
[0037] 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는개선용 식품 조성물을 제공한다.
[0038] 상기 해당화 꽃 추출물 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
[0039] 구체적으로, 본 발명의 추출물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 구체적으로는 골 대사성질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염의 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
[0040] 본 발명의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 해당화 꽃 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 하므로 안정성면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
[0041] 본 발명의 용어, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
[0042] 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 해당화 꽃 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류,과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제,알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
[0043] 또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등모든 식품을 포함할 수 있다.
[0044] 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, [0045] IL-6 매개성 질환의 예방 또는개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
[0046] 상기 해당화 꽃 추출물 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
[0047] 구체적으로, 본 발명의 해당화 꽃 추출물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에첨가할 수 있다.
[0048] 본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
[0049] 본 발명의 해당화 꽃 추출물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우,상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 분획물이나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
[0050] 상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제,산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.
[0051] 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는개선용 사료조성물을 제공한다. 또한, 상기 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 음용수 첨가제를 제공한다.
[0052] 상기 해당화 꽃 추출물의 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
[0053] 본 발명의 목적상, 해당화 꽃 추출물은 IL-6 매개성 질환의 개선을 위한 목적으로 사용될 수 있기 때문에, 사료나 음용수의 첨가제로 포함될 수 있다.
[0054] 본 발명에서 용어, 상기 "사료조성물"은 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 IL-6 매개성 질환의 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미하며, "음용수첨가제"는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 동물을 대상으로 하는 음용수에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는것으로, 본 발명에서는 IL-6 매개성 질환의 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다.
[0055] 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 상기 사료조성물에 사료첨가제로 포함될 수 있으며, 상기 사료는 동물에 공급되는 모든 식품을 총칭하는 의미로 사용될 수 있다.
[0056] 본 발명에서 용어, "동물"은 가축 및 애완동물을 포함하는 개념으로, 구체적으로는, 개, 고양이 등의 반려 동물과 돼지, 소 등일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 본 발명의 사료조성물 또는 음용수 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제,올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된것은 아니다.
발명의 효과
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는, [0057] IL-6 매개성 질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, IL-6에 의해 유도되는 신호전달체계를 저해하고, 파골세포 분화를억제함으로써 IL-6 매개성 질환, 구체적으로, 골 대사성 질환, 염증성 장질환, 또는 아토피 피부염의 예방 또는치료에 있어 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 해당화 꽃 추출물은 다른 부위의 추출물과 달리 세포독성이 없고,오랫동안 식품으로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없이 상기 질환의 치료에 이용될 수 있는 이점이있다.
도면의 간단한 설명
[0058] 도 1은 해당화 꽃 에탄올 추출물, 해당화 꽃 물 추출물, 및 해당화 열매 에탄올 추출물의 IL-6 유도 루시퍼라제발현을 저해하는 활성에 관한 것이다.
도 2는 해당화 꽃 에탄올 추출물, 해당화 물 추출물, 및 해당화 열매 에탄올 추출물의 세포독성 비교에 관한 것이다.
도 3은 해당화 꽃 에탄올 추출물과 해당화 열매 에탄올 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화를 억제하는 활성에관한 것이다.
도 4는 염증성 골다공증 마우스모델을 이용하여 해당화 꽃 추출물의 골다공증 유도 억제 효과에 관한 것이다.
도 5는 DSS 유도 염증성 장질환 동물모델에서 해당화 꽃 에탄올 추출물 및 물 추출물의 염증성 장질환 억제 효과에 관한 것이다.
도 6은 DSS 유도 염증성 장질환 동물모델에서 해당화 꽃 에탄올 추출물 및 물 추출물의 염증성사이토카인 억제효과에 관한 것이다.
도 7은 해당화 꽃 에탄올 추출물 및 물 추출물의 세포독성 비교에 관한 것이다.
도 8은 해당화 꽃 에탄올 추출물 및 물 추출물의 염증성 사이토카인 억제 효과에 관한 것이다.
도 9는 해당화 꽃 물 추출물의 염증성 사이토카인 억제 효과에 관한 것이다.
도 10은 해당화 꽃 물 추출물의 STAT1과 NF-κB 단백질 활성화 억제 효과에 관한 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0059] 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[0060] 실시예 1: 해당화 부위별 추출물 제조
[0061] 해당화의 꽃과 열매를 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 해당화 꽃과 열매 500g을 에탄올 5ℓ에 넣고 추출기를 통해 10시간 동안 70℃로 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 에탄올 용매를 제거한 후 추출된 잔사로서 해당화꽃과 열매의 에탄올 추출물을 수득하였다. 또한, 분말화된 해당화 꽃 500g을 증류수 5ℓ에 넣고 상온에서 24시간 동안 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 물을제거한 후 추출된 잔사로서 해당화 꽃의 물 추출물을 수득하였다.
[0062] 실시예 2: 해당화 꽃 추출물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 전사활성 억제 효과 확인
[0063] 해당화 부위별 추출물의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 발현억제 효과를 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
[0064] 2-1. 형질전환체 제조
[0065] Hep3B 세포(ATCC HB-8064)에 pStat3-Luc와 pcDNA3.1 (+) (Clontech laboratories, Palo Alto, CA)을lipofectamin plus(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 함께 형질감염 시켰다. 이틀 후부터 하이그로마이신(hygromycin)을 처리 (100㎍/㎖)하여 루시퍼라제(luciferase)가 안정하게 발현되는 클론(clone)을 얻었다. 이클론에서 루시퍼라제가 안정하게 발현되는지는 루시퍼라제 분석을 통해 확인하였다.
[0066] 2-2. IL-6 반응성 STAT3 리포터 유전자 검사
[0067] 상기 형질감염된 세포를 DMEM(GIBCO 119950965)으로 무혈청 배양(serum starvation)하고, 시료를 하기와 같이1시간 처리한 후, 10ng/㎖ IL-6(R&D system, USA)를 첨가하여 12시간 동안 배양하였다.
[0068] 1: 음성대조군(비처리군);
[0069] 2: 양성대조군(IL-6 10ng/㎖);
[0070] 3: 추출물(10, 30, 60㎍/㎖)
[0071] 상기 반응한 세포를 PBS로 세척하고 50μL 용해 완충용액(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20분간 교반한 후, 30-100μL의 루시퍼라제 기질(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색정도를 루미노미터(luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였다. 약물 양성대조군으로는 IL-6 활성저해 효과를 지닌 화합물인 Oleanolic Acid Acetate(OAA)를 사용하였다(Rheumatology, 2014, 53(1), 56-64). 실험 결과, 해당화 꽃 에탄올 추출물 및 물 추출물은 농도 의존적으로 STAT3 루시퍼라제 활성을 저해하고, 특히, 해당화 꽃 추출물이 60㎍/㎖일 때 97.9%의 저해 효과가 나타날 정도로 현저한 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 해당화 열매 에탄올 추출물은 해당화 꽃 추출물과 비교할 때 다소 약한 활성을 나타내었다(도 1).
[0072] 이러한 결과를 통하여, 해당화 꽃 추출물은 IL-6에 의해 유도되는 염증성 질환의 신호전달과정에서 중요한 매개자인 STAT3 루시퍼라제의 전사활성을 현저하게 저해함으로써, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
[0073] 실시예 3: 해당화 꽃 추출물의 세포독성 효과 확인
[0074] 상기 형질감염된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 DMEM(GIBCO 119950965)으로 무혈청 배양(serumstarvation)하고, 시료를 하기와 같이 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
[0075] 1: 음성대조군(비처리군);
[0076] 2: 양성대조군(IL-6 10ng/㎖);
[0077] 3: 추출물(10, 30, 60㎍/㎖)
[0078] 24시간을 반응한 뒤, MTT 용액(5mg/ml)을 20μL씩 각 웰(well)에 넣어준 후 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 제거한 다음 100μL의 DMSO를 넣어주어, MTT 반응으로 생긴 formazan crystal을 녹여주었다. 그 후 발색정도를 플레이트 리더(plate reader, Model 680, BIO-RAD)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 해당화의 꽃 에탄올 추출물에서는 꽃 추출물이 60㎍/㎖일 때에도 세포의 생존 능력이 80% 이상으로 나타나 심각한 세포독성이 나타나지 않은 반면, 해당화 열매 에탄올 추출물의 경우는 전반적으로 세포 독성이 클 뿐아니라, 60㎍/㎖일 때 66.8%의 생존 능력이 나타나 꽃 추출물보다 세포독성이 훨씬 크다는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 이를 통해 해당화 꽃 추출물은 열매 추출물에 비해 안전한 물질임을 알 수 있었으며, 상기 실시예 2의 결과와 조합하여 해당화 열매 추출물에 대한 결과를 보면, 상기 해당화 열매 추출물이 실시예 2에서 IL-6에의해 유도되는 STAT3 루시퍼라제 저해활성을 가지는 것은 세포독성에 의해 유도되어진 것임을 예측할 수있었다.
[0079] 실시예 4: 해당화 꽃 에탄올 추출물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제 효과 확인
[0080] 상기 실시예　2에서 골다공증과 연관되어 있는 IL-6에 의해 유도된 STAT3 전사활성 억제 효과를 확인하였는바,해당화 꽃 에탄올 추출물이 보다 직접적인 골다공증 치료 효능을 가짐을 확인하고자 하였다.
해당화 꽃 에탄올 추출물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제 효과를 [0081] 측정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 5주령 생쥐의 넓적다리뼈와 정강이뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF(30ng/㎖)가 포함된 a-MEM(a-minimum essentialmedium) 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF(30ng/㎖)와 RANKL(50ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 해당화 꽃 에탄올 추출물을 60, 30 또는 10㎍/㎖로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 분화된 뼈파골세포로 판단하였다. 그 결과, 해당화 꽃의 에탄올 추출물은 60, 30㎍/㎖ 농도에서RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제하는 활성이 우수하였다. 이에 반해 해당화 열매 에탄올 추출물은파골세포 분화 억제 활성이 미미하였다(도 3).
[0082] 이러한 결과를 통하여 해당화 열매 추출물은 골다공증에 대한 효과가 매우 미미한 반면, 해당화 꽃 추출물은 우수한 골다공증 치료 효과를 가질 수 있음을 알 수 있었다.
[0083] 실시예 5: 염증성 골다공증 마우스모델을 이용한 해당화 꽃 에탄올 추출물의 골다공증 유도 억제 효과
[0084] 해당화 꽃 에탄올 추출물의 골다공증 유도 억제 효과를 확인하기 위해서 염증성 골다공증 마우스모델을 작성하였다. 7주령 C57BL/6 암컷 마우스의 두개골 피하부분에 LPS 25mg/kg를 1주일에 1회씩, 총 3회에 걸쳐 피하주사를 하였다. 실험군은 PBS, LPS, LPS+alendronate (2mg/kg), LPS + 해당화 꽃 에탄올 추출물 (100mg/kg,300mg/kg, 600mg/kg)의 6 그룹으로 나누었다. PBS군은 LPS를 투여하지 않은 정상대조군, 나머지 그룹은 LPS 유도 골다공증 그룹으로, 골다공증의 치료제인 알렌드로네이트(alendronate) 투여군은 양성대조군 및 해당화 시험군은 총 4주간 하루 1회 각각의 약물을 경구투여 하였다.
[0085] 4주간의 경구 투여가 종료 후, Dual energy X-ray analysis (DEXA)를 실시하여 골밀도(Bone mineral density,BMD) 및 골질량(bone mineral contents, BMC)을 측정함으로써, 골다공증에 대한 해당화 꽃 에탄올 추출물의 치료효과를 평가하였다. 그 결과, LPS 유도 그룹에서 낮아진 골밀도 및 골질량은 골다공증 치료제 투여군에서 유의적으로 회복되었으며, 해당화 꽃 에탄올 추출물 투여군(300mg/kg, 600mg/kg)에서도 유의적인 회복효과가 확인되었다(LPS 그룹과 비교할 때, *p<0.05)(도 4).
[0086] 실시예 6: 염증성 장질환 마우스모델을 이용한 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물의 염증성 장질환 억제 효과[0087] 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물의 염증성 장질환 억제 효과를 확인하기 위해서 염증성 장질환 마우스모델을 작성하였다. 4주령의 ICR male 마우스 (오리엔트 바이오 구입)를 12시간 동안 dark-light cycle에 적응을 시키고,실험 시작 전 7일간의 적응기를 가졌다. 대조군 그룹을 제외하고, 나머지 그룹은 증류수에 DSS를 첨가시켜 3%DSS 용액을 만들고, 14일 동안 임의량(ad libitum)을 섭취시켜 IBD 동물모델을 만들었다. 3% DSS를 첨가시키기이틀 전부터 대조군, 3% DSS 그룹은 PBS, sulfasalazine(SS) 그룹은 sulfasalazine 50mg/kg, 해당화 꽃 에탄올및 물 추출물 그룹은 500mg/kg를 매일 경구투여하였다. 16일 후에 마우스는 경추탈골로 희생시켜 혈액, 비장,장 부위를 절단하여 상태를 확인하였다. 장은 맹장부터 직장까지 절단하여 길이를 측정하였고, 결장부위와 직장부위를 조직학에 사용하였다.
[0088] 그 결과, 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물 500mg/kg를 처리한 실험 군에서 DSS 처리에 의해 유도되는 IBD 증상을치료하는 효과가 우수하고(도 5), 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물을 처리한 실험 군에서 DSS 처리에 의해 유도되는 염증성사이토카인(IL-6, IL-17, IFN-γ)을 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다(도 6).
[0089] 실시예 7: 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물의 항아토피 효능 검증 실험
[0090] 7-1: HaCaT 세포를 이용한 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물의 항아토피 효과
[0091] 인간 케라틴 세포 라인(human keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포를 이용하여 해당화 꽃 에탄올 및 물 추출물의 항아토피 효과를 확인하였다. 상기 HaCaT 세포는 10%의 열-비활성화된(heat-inactivated) FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium) 배지에서 37℃ 및 5 %의 CO2 조건하에 배양하였다. 배양이 끝난 세포의 생존률은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다. MTT 용액은 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 디하이드로게나아제(dehydrogenases)에 의해서 포르마잔(formazan)을 형성하여 세포의 생존 여부를 확인할수 있었다. 세포독성을 확인하기 위해 HaCaT 세포를 96 웰 플레이트에 5×104세포/웰로 37℃에서 배양한 후, 해당화 꽃 에탄올 추출물을 100~2,000㎍/ml, 물 추출물을 100~10,000㎍/ml로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
24시간이 지난 후, 각 웰에 20㎕의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후 배양액을 제거하고 100㎕의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 해당화 꽃 에탄올 추출물과 물 추출물은 HaCaT 세포에서 500㎍/ml 이하의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(도 7).
아토피 피부염 관련 사이토카인을 확인하기 위해, 배양된 HaCaT 세포에 TNF-α/[0092] INF-γ를 처리하여, 아토피 유사환경을 유도한 뒤 해당화 꽃 에탄올 추출물, 물 추출물을 각각 1000㎍/ml로 처리 및 배양하고, 세포에서 RNA를추출하였다. 이때 덱사메타손(Dexamethasone) 10㎍/ml은 항아토피 효과를 가져 양성대조군으로 사용되었다. RNA분리 키트(RNAiso Plus reagent, Takarabio 사)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, 분리된 전체 RNA의 흡광도를 측정하여 정량한 후, 2㎍의 RNA로 cDNA를 합성하였다. 각 튜브당 2μL의 cDNA, 1㎕의 센스 및 안티센스 프라이머 용액(0.4μM), 12.5μL의 SYBR Premix Ex Taq (Takarabio사)와 9.5μL의 dH2O를 함께 혼합하여총 25μL가 되도록 하였다. TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 CCL17 mRNA의 발현 정도는 TP850 소프트웨어를 사용해real-time PCR을 통해 측정하였다. HaCaT 세포에서 아토피 유발 시 발현하는 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 CCL17사이토카인을 확인하였다.
[0093] 그 결과, 1,000㎍/ml 농도에서 해당화 꽃 에탄올 추출물보다 물 추출물이 사이토카인 억제 효과가 더 우수하고(도 8), 해당화 물 추출물을 농도별로 1, 10, 100㎍/ml로 처리한 결과, 농도 의존적으로 사이토카인 발현량을억제하는 것을 확인하였다(도 9).
[0094] 실시예 7-2: 해당화 꽃 물 추출물이 염증 유발성 사이토카인의 발현을 억제하는 과정에 관여하는 신호전달 기전[0095] 해당화 꽃 물 추출물이 염증 유발성 사이토카인의 발현을 억제하는 과정에 관여하는 신호전달 기전을 밝히기 위해, STAT1의 인산화와 염증성 사이토카인의 전사를 조절하는 인자로서 중요한 신호 전달 물질인 NF-ĸB의 활성화에 대해 측정하였다. 비활성 상태의 NF-ĸB는 내인성 억제 단백질인 IĸBα에 결합하여 비활성화 상태를 유지하다가, 활성화되면 IĸBα가 인산화되어 분해되면서 이들로부터 유리되어 핵으로 이동하여 전사인자로써 활동하므로, IĸBα에 대한 분해 영향을 아울러 측정하였다. HaCaT 세포를 0.5mM 페닐메탄에설포닐 플루오라이드(Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma사, Cat No. P7626)와 5㎍/mL의 류펩틴(leupeptin, Sigma 사, CatNo. L2884)을 함유한 추출완충액(0.5% triton X-100, 1mM Na3VO4 등을 함유한 PBS용액)으로 용해시킨 후, 소니케이션(sonication)하여 DNA를 조각내었다. 단백질량은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여Bio-Rad 사의 protein assay kit(Cat No. 500-0002)를 이용해서 측정하였다. 세포의 총 단백 10~50㎍을 0.1％SDS를 함유한 8~12％(w/v) 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하고, 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅(electroblotting) 방법으로 니트로셀룰로오스(nitrocellulose, NC) 필터에 옮긴 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 니트로셀룰로오스 필터를 5％ 탈지분유를 함유한 tris-buffered salinetween(TBS-tween, Sigma 사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터를 타겟 단백질에 대한 항체를함유한 TBS-tween 용액에 넣고 4℃에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP(horseradish peroxidase, Sigma 사, CatNo. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며, ECL(Enhanced chemiluminescence, Thermo scientific 사, CatNo. 34080)을 이용하여 밴드들을 측정하였다. 그 결과, 해당화 꽃 물 추출물은 TNF-α/INF-γ에 의해 활성화된STAT1의 인산화를 저해하고 IκBα의 분해를 억제하여 핵 내의 NF-ĸB가 감소함을 확인하였다(도 10). 이를 통해, 해당화 꽃 물 추출물은 STAT1과 NF-κB의 활성화를 억제하여 염증성 사이토카인 발현량을 감소시켜 항아토피 효과가 있을 것이라 예측할 수 있다.
[0096] 상기와 같은 결과는 본 발명의 해당화 꽃 추출물은 IL-6 매개성 질환을 치료할 수 있고, 특히, 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하여 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환, 염증성 장질환 및 아토피 피부염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.
[0097] 이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.