특허권

miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학조성물

상품번호 2020011620502940
IPC 한국(KO) 등록
출원번호 1020150111577
공개번호 10-2017-0017519
등록번호 1017134280000
출원인 울산대학교 산학협력단
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본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 miR 218-2는 염증 신호에 의해 활성화되는 염증성 인자의 발현을 억제하고 파골세포로의 분화를 유도하는 RANK 단백질의 발현을 억제하여 염증성 뼈 소실을 억제하는 하는 것이 확인됨에 따라, miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 염증성 뼈 질환 치료제 및 파골세포 분화 억제제로 사용할 수 있으며, 혈액 내 대식세포의 miR 218-2 발현 정도를 확인하여 뼈 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.

청구범위
청구항 1
miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 2
삭제
청구항 3

제1항에 있어서, 상기 miR 218-2는 염증성 인자의 발현을 억제하고, RANK 단백질의 발현을 억제하여 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 4
삭제
청구항 5
분리된 혈액에서 대식세포를 분리하는 단계; 및상기 분리된 대식세포의 miR 218-2 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 진단에 유용한 정보를제공하는 방법.
청구항 6
제5항에 있어서, 상기 진단방법은 혈액 유래 대식세포의 miR 218-2 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 퇴행성관절염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7
삭제
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 [0001] 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 뼈는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸고 있어 외부의 충격으로부터 내부 장기를보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성 및 흡수과정을 지속적으로 반복하여 균형을 유지시키는데,이를 뼈의 재형성이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 뼈의 기능을 적절히 유지하는데 필수적이다.
[0003] 뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있는데, 뼈를 형성하는 조골세포(osteoblast)와 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)에 의해 건강한 뼈가 유지된다. 파골세포의 분화 및 활성을 위해서는 랭클(RANKL)이라는 단백질이 중요한 역할을 하는데, 랭클은 파골 전구세포 표면에 존재하는 수용체 랭크(RANK)와결합하여 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수가 일어난다.
[0004] 따라서, 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 상기 기작을 통하여 파골세포에 의해 이루어지며, 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용되며, 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건하게 된다.
그러나, 뼈의 형성과 파괴의 평형이 깨지게 되면 여러 가지 뼈 질환이 유발되는데, [0005] 그 중 염증반응에 의한 파골전구 세포의 이동 및 분화 증가는 과도한 뼈 흡수를 유도하고 이러한 현상은 뼈 질환을 유발하는 병인으로 작용하고 있다.
[0006] 이러한 염증반응에 의한 과도한 뼈의 파괴는 골밀도 감소를 유발하여 골다공증과 같은 질환의 원인이 되기 때문에 염증반응에 의해 유도되는 파골세포의 과분화를 억제하여 골밀도 감소에 따른 뼈 질환을 예방하거나 치료할수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
선행기술문헌
특허문헌
[0007] (특허문헌 0001) 한국등록특허 제10-1264014호(2013.05.07)
발명의 내용
해결하려는 과제
[0008] 본 발명은 염증반응에 의해 유도되는 파골세포의 분화를 억제하는 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 조성물을염증성 뼈 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 약학조성물 및 파골세포 분화 억제제로 제공하고자 한다.
과제의 해결 수단
[0009] 본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자한다.
[0010] 본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제제를 제공하고자 한다.
[0011] 또한, 본 발명은 혈액에서 대식세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 대식세포의 miR 218-2 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 염증성 뼈 질환 진단방법을 제공하고자 한다.
발명의 효과
[0012] 본 발명에 따르면, miR 218-2는 염증 신호에 의해 활성화되는 염증성 인자의 발현을 억제하고 파골세포로의 분화를 유도하는 RANK 단백질의 발현을 억제하여 염증성 뼈 소실을 억제하는 하는 것이 확인됨에 따라, miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 염증성 뼈 질환 치료제 및 파골세포 분화 억제제로 사용할 수 있으며, 혈액내 대식세포의 miR 218-2 발현 정도를 확인하여 뼈 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0013] 도 1은 SLIT3 및 miR 218-2가 염증 신호에 의해 유도되는 염증성 인자들의 발현에 미치는 영향을 확인한결과로, 도 1A는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포를 LPS로 자극시켜 SLIT3이 염증성 인자들의 발현에 미치는영향을 확인한 결과이며, 도 1B는 LPS로 자극시킨 대식세포에 miR 218-2 억제제를 처리하여 miR 218-2이 염증성인자들의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 2는 염증 신호인 LPS에 의한 SLIT3을 활성을 확인한 결과로, 도 1A는 LPS에 의한 SLIT3 및 ROBO1의 RNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 결과이며, 도 1B는 실시간 PCR 결과이며, 도 1C는 SLIT3 및 ROBO1 단백질의 발현 수준및 발현 위치를 확인한 형광면역염색 결과이다.
도 3은 SLIT3의 파골세포분화 조절 효과를 확인한 결과로, 도 3A는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포에서 LPS처리에 따른 SLIT3 mRNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 결과이며, 도 3B는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포에서LPS 처리에 따른 RANK(Tnfrsf11a) mRNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 결과이며, 도 3C는 LPS가 처리된 대식세포서 파골세포분화에 주요 신호 단백질인 RANK(Tnfrsf11a)와 Csf1r(M-CSF 수용체) 발현 수준을 확인한 GEO 프로필 분석결과이며, 도 3D는 LPS가 처리된 대식세포에서 RANK(Tnfrsf11a)와 Csf1r(M-CSF 수용체) mRNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 및 실시간 PCR 결과이다.
도 4는 SLIT3 발현이 RANKL에 의한 파골세포분화에 미치는 영향을 확인한 결과로, 도 4A는 RANKL이 처리된 대식세포에 LPS를 처리하거나 비처리하고 3일 후 TRAP 염색하여 대식세포의 파골세포 분화 정도를 확인한 결과이며,도 4B는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포에 LPS를 처리 또는 비처리하고 3일 후 TRAP 염색하여 파골세포 분화 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 SLIT3 발현과 상관없이 LPS에 의한 신호과정에 따른 단백질 발현 효과를 확인한 결과로, 도 5A는 SLIT3siRNA가 형질주입된 대식세포에 LPS를 10 ng/ml 농도로 표시된 시간 동안 처리하고 LPS 처리에 의해 발현되는단백질의 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이며, 도 5B는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포에서 LPS 처리에 따른 miR 218-2의 발현 정도를 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 6은 miR 218-2가 RANK 발현에 미치는 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 SLIT3 siRNA가 형질주입된 대식세포에1 및 10 ng/ml 농도의 LPS를 처리하고 miR 218-2 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 6B는 miR 218-2가 결합하는RANK 3'TUR 영역의 2개의 부위 및 이를 돌연변이 시킨 모식도이며, 도 6C는 WT 플라스미드 DNA 또는 각각의 돌연변이 플라스미드 DNA(Mut1, Mut2 또는 Mut1/Mut2)를 마우스 NIH 3T3 세포에 100 nM 농도의 miR 218-2 모의체(mimic) 올리고뉴클레오타이드와 함께 형질주입하고 24시간 후 수행한 루시퍼레이즈 분석결과이며, 도 6D는 RTPCR결과이며, 도 6E는 실시간 RT-PCR 결과이며, 도 6F는 miR 218-2 또는 anti-miR 218-2를 세포에 형질주입하고 24시간 후 RANKL 및 LPS로 자극을 주어 파골세포분화를 유도하여 miR 218-2가 파골세포분화 미치는 영향을확인한 결과이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 염증성 뼈 질환 예방 또는 치료용 [0014] 약학조성물을 제공할 수 있다.
[0015] 상기 염증성 뼈 질환은 골다공증, 퇴행성 관절염 및 강직성 척추염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0016] 상기 miR 218-2는 염증성 인자의 발현을 억제하고, RANK 단백질의 발현을 억제하여 파골세포로의 분화를 억제할수 있다.
[0017] 본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1과 같이 SILT3 및 miR 218-2는 염증 신호인 LPS에 의해 활성화되는 단백질로SILT3가 활성화될 경우, 염증성 인자의 발현이 증가되는 반면, miR 218-2는 염증신호인 LPS에 의해 활성화되는염증성 인자의 발현을 억제시키는 효과를 나타내었다. 또한, miR 218-2는 파골세포분화를 유도하는 RANKL 신호작용에 있어서, RANKL 단백질이 결합하는 수용체 단백질인 RANK의 발현을 억제하여 대식세포의 파골세포로의 분를 억제하는 것을 확인함에 따라, 본 발명의 miR 218-2는 염증 신호로부터 발현이 유도되는 염증성 인자의 발현 및 파골세포분화를 억제하여 염증성 뼈 소실에 의한 뼈 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
[0018] 또한, 본 발명은 miR 218-2를 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제제로 사용될 수 있다.
[0019] 본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물 100 중량부에 대하여 miR 218-2를 0.01 내지 90 중량부, 0.1 내지 90 중량부, 1 내지 90 중량부 또는 10 내지 90 중량부로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다.
[0020] 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
[0021] 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨,말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제,캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제,유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 약학조성물의 [0022] 제형은 과립제, 산제, 피

[0023] 복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택될 수있다.
[0024] 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내,근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
[0025] 상기 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 1,000 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 1,000 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[0026] 본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
[0027] 본 발명은 혈액에서 대식세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 대식세포의 miR 218-2 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 염증성 뼈 질환 진단방법을 제공할 수 있다.
[0028] 보다 상세하게는 혈액 유래 대식세포에서 miR 218-2 발현이 감소되는 것을 확인하여 염증성 뼈 질환을 진단할수 있다.
[0029] 또한, 본 발명은 miR 218-2를 검출하는 제제를 포함하는 염증성 뼈 질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수있다.
[0030] 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[0031] <실시예 1> 염증 신호에 의한 단백질 활성 확인
[0032] 염증 신호인 LPS에 의해 발현되는 SLIT3과 miR 218-2가 대식세포에 미치는 영향을 확인하였다.
[0033] 대식세포에 SLIT3 siRNA(Thermo Scientific Dharmacon, Lafayette, CO) 또는 control siRNA(ThermoScientific Dharmacon)를 각각 형질주입하고 24시간 후, 10 ng/ml LPS를 처리하여 4시간 동안 자극을 주었다.
그 후, LPS에 의한 염증성 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해, 세포를 수집하여 RNA를 추출하고 cDNA 합성 후특이적인 MMP-9, IL-1β, TNF-α 및 IL-6 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
[0034] 그 결과, 도 1A와 같이 SLIT3의 활성이 감소된 경우, 염증성 인자인 MMP-9, TNF-α 및 IL-6의 RNA 발현이 감소하였다.
[0035] 또한, LPS를 처리하여 miR 218-2 활성이 증가된 대식세포에 miR 218-2 활성 억제제인 anti-miR 218-2(Qiagen,Hilden, Germany)를 처리한 후, 세포를 수집하여 RNA를 추출하고 cDNA 합성 후 특이적인 MMP-9, IL-1β, TNF-α 및 IL-6 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
[0036] 그 결과, 도 1B와 같이 miR 218-2 활성 억제제에 의해 miR 218-2 활성이 억제됨에 따라, 염증성 단백질인 MMP-9, IL-1β, TNF-α 및 IL-6 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[0037] 상기 결과로부터 염증 신호에 의해 발현되는 SLIT3 및 miR 218-2는 서로 다른 이중 신호를 통하여 대식세포의분화 및 활성을 조절하는 신호 인자로 작용하는 것이 확인되었다.
[0038] <실시예 2> 염증 신호에 따른 SLIT3 및 ROBO1 단백질의 발현 수준 확인앞선 실험결과를 확인하기 위해, 골수(Bone marrow)에서 유래된 대식세포를 배양 플레이트에 5×105
[0039] 세포로 분주하고 24시간 배양한 후, 1 또는 10 ng/ml 농도의 LPS를 4시간 동안 처리하여 자극을 주고 세포를 수집하여RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고 특이적인 SLIT3 및 ROBO1 수용체의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였으며, RT-PCR 및 실시간 PCR를 수행하여 발현량을 확인하였다.
또한, SLIT3과 ROBO1의 단백질의 발현 수준 및 위치를 확인하기 위해, 커버 글라스에 8×103
[0040] 개의 대식세포를 부
착시키고 10 ng/ml 농도의 LPS를 6시간 동안 처리하여 자극을 주고 세포를 고정한 후, 특이적인 SLIT3과 ROBO1의 1차 항체를 결합시키고 2차 항체인 Alexa-fluor 488 dye(녹색)로 SLIT3를 발현시켰으며, Alexa-fluor 649dye(적색)로 ROBO1를 발현시켜 SLIT3과 ROBO1 단백질의 발현 수준과 위치를 확인하였다.
[0041] 그 결과, 도 2와 같이 LPS에 의해 SLIT3과 ROBO1 단백질의 발현 수준이 증가하였으며, 상기 단백질 모두 핵막주변에서 높은 발현밀도를 나타내었다.
[0042] 또한, 움직이는 세포의 원형질막(plasma membrane)에서도 SLIT3과 ROBO1 단백질의 발현이 확인되었다.
[0043] 상기 결과로부터 LPS에 의한 염증 신호가 SLIT3과 ROBO1 단백질의 발현에 관여하는 것을 확인할 수 있었다.
[0044] <실시예 3> SLIT3의 RANK 발현 조절능력 확인
[0045] 앞선 실험결과와 같이 LPS에 의해 발현이 증가된 SLIT3가 RANK 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, SLIT3 특이적 siRNA 100 nM의 농도로 세포에 도입하고, 24시간 배양한 후 세포를 수집하여 siRNA을 추출하고, RT-PCR 및실시간 PCR를 수행하여 단백질 발현 변화를 확인하였다.
[0046] 그 결과, 도 3과 같이 SLIT3 siRNA 도입 후 LPS에 의해 증가되었던 SLIT3 단백질의 발현이 감소하였으며, SLIT3에 의해 발현이 억제되었던 RANK의 발현이 회복되었다.
[0047] 실제로 GEO profile analysis 분석 결과에 따르면, LPS 신호에 의해 골수 유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophages; BMMs)에서 파골세포형성(Osteoclastogenesis)에 주요한 신호 단백질인 RANK와 Csf1r(M-CSF 수용체)의 발현이 감소되는 것으로 보고되었으며, 본 발명자들 역시 도 3과 같이 LPS 신호에 의해 RANK와 Csf1r의발현이 감소되는 것을 RT-PCR 및 실시간 PCR을 통하여 확인되었으며, 상기 결과로부터 RANK 발현이 SLIT3에 의해 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
[0048] 파골세포분화에 있어서, 염증신호 물질인 LPS는 RANK의 발현을 억제하여 RANKL의 활성을 억제시킴으로써, 초기의 파골세포분화를 억제하는 것으로 알려져있다.
[0049] 이를 확인하기 위해, RANKL 및 LPS를 세포에 처리한 결과, 도 4A와 같이 RANKL 와 LPS가 처리된 실험군에서는파골세포분화가 현저하게 감소한 것이 확인되었다. 이에 대하여, SLIT3의 기능을 확인하기 위해 SLIT3 특이적siRNA를 세포에 도입하고 24시간 배양 후, RANKL 및 LPS를 처리하여 파골세포의 분화를 유도하고 분화유도 3일후, 세포를 고정하여 TRAP 염색(PMID: 24664887; Lee et al., PTX3 stimulates osteoclastogenesis byincreasing osteoblast RANKL production, J Cell Physiol. 2014 Nov;229(11):1744-52)을 수행하였다.

[0050] 그 결과, 도 4B와 같이 SLIT3 발현이 억제된 세포군에서는 LPS 처리에 의해 파골세포 분화가 다시 회복되는 것이 확인되었다.
[0051] 상기 결과로부터 LPS에 의한 RANK의 발현억제는 SLIT3 발현 억제를 통하여 회복될 수 있으며, 이는 RANKL 신호과정이 활성화되어 파골세포분화가 부분적으로 회복될 수 있음을 시사한다.
[0052] 상기 결과와 같이 SLIT3 발현 억제에도 LPS에 의한 신호전달 과정이 독립적으로 조절될 수 있는지를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.먼저, 대식세포 5×105
[0053] 세포를 6-well 플레이트에 분주하여 24시간 배양하고, 대조군 siRNA 또는 SLIT3 siRNA100 nM을 리포펙타민 RNAi Max reagent를 이용하여 형질주입시켰다. 형질주입 24시간 후 LPS 10 ng/ml로 표시된 시간에 따라 자극을 주고 2×SDS-sample buffer를 이용하여 단백질을 수집한 후 각각의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다.
[0054] 그 결과, 도 5A와 같이 LPS에 영향을 받는 단백질들의 발현 및 활성이 SLIT3 넉아웃이 되었어도 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다.
[0055] 상기 결과로부터 본 발명가들은 LPS에 의해 RANK의 발현을 조절하는 다른 인자가 있을 것으로 예상하고 SLIT3발현에 의해 조절되는 miR 218-2의 발현을 확인하였다.
[0056] 그 결과, 도 5B와 같이 특이적으로 LPS에 의해서도 miR 218-2의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
[0057] 상기 결과로부터 SLIT3의 인트론에 코딩되어 SLIT3 발현에 따라 조절되는 miRNA로 알려져 있는 miR 218-2이 LPS에 의해서도 발현이 조절될 수 있음이 확인됨에 따라, miR 218-2가 RANK의 발현을 조절할 수 있을 것으로 제안될 수 있다.
<실시예 4> miR 218-[0058] 2의 RANK 발현 조절능력 확인
[0059] 앞선 실험결과를 확인하기 위해, 먼저 miR 218-2에 의해 SLIT3의 발현이 조절될 수 있는지 확인하였다.
[0060] 세포에 SLIT3 siRNA를 형질주입하고 24시간 후 10 ng/ml LPS를 처리하여 세포를 자극시키고 세포를 수집하여 단백질 발현량을 확인하였다.
[0061] 그 결과, 도 6A와 같이 대조군에서는 LPS에 의해 miR 218-2의 발현이 증가된 반면, SLIT3 발현이 억제된 세포에서는 miR 218-2의 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.
[0062] 상기 결과로부터 miR 218-2의 발현이 SLIT3에 의해 조절되어 지는 것이 확인되었다.
[0063] 다음으로, miR 218-2가 RANK 3'UTR 영역에 결합할 수 있는지를 miR binding prediction program을 이용하여 확인하였다.
[0064] 그 결과, 도 6B와 같이 RANK 3'UTR 영역에 miR 218-2가 결합할 수 있는 2개의 부위를 확인하였다.
[0065] 상기 확인된 2개의 부위에 miR 218-2가 결합하여 RANK의 발현을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, RANK 3'UTR1kb 영역을 pMIR-리포트 벡터 DNA에 클로닝하고(도 6B, WT), 각각 두 개의 결합 부위(binding site)는 pMIR-리포트를 기본으로 한 Muta-Direct TM
Site-directed mutagenesis kit(intron, seoul)를 이용하여 돌연변이 시켰다
(도 6B, Mut1 또는 Mut2).
[0066] 상기 WT 플라스미드 DNA 또는 각각의 돌연변이 플라스미드 DNA(Mut1, Mut2 또는 Mut1/Mut2)를 마우스 NIH 3T3세포에 100 nM 농도의 miR 218-2 모의체(mimic) 올리고뉴클레오타이드와 함께 형질주입하였다.
[0067] 형질주입 24시간 후, 세포를 수집하여 단백질을 추출하고 루시퍼레이즈 분석을 수행하였다.
[0068] 그 결과, 도 6C와 같이 WT에서는 miR 218-2에 의해 활성이 감소된 반면, 두 개의 결합 부위를 모두 돌연변이시킨 군에서는 활성 저하가 나타나지 않았다.
[0069] 또한, RT-PCR 결과(도 6D) 및 실시간 RT-PCR 결과(도 6E), LPS가 처리된 세포군과 miR 218-2가 형질주입된 세포군에서는 RANK의 발현이 감소된 반면, anti-miR 218-2가 형질주입된 세포군과 LPS와 anti-miR 218-2를 함께처리하여 miR 218-2의 활성을 억제시킨 세포군에서는 RANK의 발현이 현저하게 증가하였다.
[0070] 또한, miR 218-2가 파골세포분화에 영향을 줄 수 있는지를 확인하기 위해, 각각 100 nM 농도의 miR 218-2 또는anti-miR 218-2를 세포에 형질주입하고 24시간 후 RANKL 및 LPS로 자극을 주어 파골세포분화를 유도하였다.
[0071] 그 결과, 도 6F와 같이 miR 218-2가 형질주입된 세포에서 파골세포로의 분화가 감소된 반면, anti-miR 218-2가형질주입된 세포에서는 파골세포로의 분화가 증가 되었으며, LPS와 anti-miR 218-2가 함께 처리된 세포군에서도LPS에 의한 miR 218-2 활성 증가가 억제됨에 따라 파골세포분화가 증가된 것을 확인할 수 있었다.
[0072] 상기 결과로부터 miR 218-2의 발현은 RANK의 발현을 타겟으로 하며, LPS에 의한 신호활성을 통하여 파골세포분화를 음성 조절하는 것을 확인할 수 있었다.
표 1
[0073] 이름 서열(5'-3') Accession 서열번호
mir-218-2(mmu-mir-218-2-3p) CAUGGUUCUGUCAAGCACCGCG MIMAT0005444 1
ROBO1 정방향 프라이머 AGGGAAGCCTACGCAGATG NM_09413.2 2
역방향 프라이머 TGGACAGTGGGCGATTTTAT 3
SLIT3 정방향 프라이머 CTAAACCAGACCCTGAACCTGGTGGTAGAC NM_011412.3 4
역방향 프라이머 AAGGTAGAGGGGGCTGTTGCTGCCCACT 5
MMP-9 정방향 프라이머 GAGACGGGTATCCCTTCGAC NM_013599.3 6
역방향 프라이머 TGACATGGGGCACCATTTGAG 7
IL-1β 정방향 프라이머 AAATACCTGTGGCCTTG NM_008361.3 8
역방향 프라이머 TTAGGAAGACACGGATTC 9
TNF-α 정방향 프라이머 AGTGACAAGCCTGTAGCC NM_013693.3 10
역방향 프라이머 AGGTTGACTTTCTCCTGG 11
IL-6 정방향 프라이머 GGAGTACCATAGCTACCTGG NM_031168.1 12
역방향 프라이머 CTAGGTTTGCCGAGTAGATC 13c-fms(csf1r)
정방향 프라이머 CCCACCCTGAAGTCCTGAGT NM_001037859.2 14
역방향 프라이머 CTTTGTCCTAGGGAGACGGC 15RANK(Tnfrsf11a)
정방향 프라이머 CAGATGTCTTTTCGTCCACAGA NM_009399.3 16
역방향 프라이머 AGACTGGGCAGGTAAGCCT 17
GAPDH 정방향 프라이머 TGGCCTTCCGTGTTCCTAC GU214026.1 18

역방향 프라이머 GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA 19
이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 [0074] 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[0075] <제제예 1> 주사제의 제조
[0076] miR 218-2 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증
류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
[0077] <제제예 2> 정제의 제조
[0078] miR 218-2 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에따라 타정하여 정제를 제조하였다.
[0079] <제제예 3> 캡슐제의 제조
[0080] miR 218-2 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
[0081] 이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서,이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할것이다.
서 열 목 록
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation
<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating
inflammatory bone disease comprising miR 218-2
<130> ADP-2015-0236
<160> 19
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-218-2
<400> 1
caugguucug ucaagcaccg cg 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> ROBO1 forward primer
<400> 2
agggaagcct acgcagatg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> ROBO1 reverse primer
<400> 3
tggacagtgg gcgattttat 20
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> SLIT3 forward primer
<400> 4
ctaaaccaga ccctgaacct ggtggtagac 30
<210> 5
<211
> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> SLIT3 reverse primer
<400> 5
aaggtagagg gggctgttgc tgcccact 28
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> MMP-9 forward primer
<400> 6
gagacgggta tcccttcgac 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> MMP-9 reverse primer
<400> 7
tgacatgggg caccatttga g 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> IL-1 beta forward primer
<400> 8
aaatacctgt ggccttg 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> IL-1 beta reverse primer
<400> 9
ttaggaagac acggattc 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> TNF-a forward primer
<400> 10
agtgacaagc ctgtagcc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> TNF-a reverse primer
<400> 11
aggttgactt tctcctgg 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> IL-6 forward primer
<400> 12
ggagtaccat agctacctgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> IL-6 reverse primer
<400> 13
ctaggtttgc cgagtagatc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> c-fms forward primer
<400> 14
cccaccctga agtcctgagt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> c-fms reverse primer
<400> 15
ctttgtccta gggagacggc 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> RANK forward primer
<400> 16
cagatgtctt ttcgtccaca ga 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> RANK reverse primer
<400> 17
agactgggca ggtaagcct 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> GAPDH forward primer
<400> 18
tggccttccg tgttcctac 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223> GAPDH reverse primer
<400> 19
gagttgctgt tgaagtcgca 20 

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