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청구범위
청구항 1
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청구항 2
생체외(in vitro)에서, 대식세포를 지질다당류(Lipopolysaccharide), 인터페론 감마, IL-4 및 IL-13로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 극성 유도 물질을 통해 M1 대식세포로 극성 유도하는 단계를 포하고, 상기 극성 유도 물질과 항결핵 약제를 병용하는, 결핵균의 생존 및 증식 억제 방법으로, 상기 항결핵약제는 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol) 또는 피라진아미드(Pyrazinamide)인 것을 특징으로 하는 결핵균의 생존 및 증식 억제방법.
청구항 3
제2항에 있어서,상기 인터페론 감마, IL-4 및 IL-13은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 결핵균의 생존 및 증식 억제방법.
청구항 4
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청구항 5
제2항에 있어서, 상기 지질다당류(Lipopolysaccharide)의 양은 1~20ng/ml이며 인터페론감마의 양은1~20ng/ml인 것을 포함하는 결핵균의 생존 및 증식 억제방법.
청구항 6
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청구항 7
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청구항 8
제2항, 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다약제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵인결핵균의 생존 및 증식 억제방법.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 전반적으로 면역학 분야에 관한 것이며, 부분적으로 결핵균의 생존 [0001] 및 증식을 억제하는 방법에 관한것이며 이를 위한 대식세포(macrophage)의 극성(polarization)조절 방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 결핵은 결핵균 및 다른 마이코박테리움(Mycobacterium)종의 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. 결핵은 매년 약 8백만명의 신규 감염자가 발생되며 3백만명의 목숨을 앗아가는 개발도상국의 주요 질병이며, 또한선진국에서도 문제점으로 부각되고 있다. 상당한 기간 동안 감염은 무증상일 수 있으나, 결핵은 가장 공통적인증상으로서 폐의 급성 염증을 나타내며, 그 결과 발열 및 마른 기침(nonproductive cough)을 유발시킨다. 치료하지 않으면, 일반적으로 심각한 합병증 및 사망을 초래한다.
결핵은 장기간에 걸친 항생제 요법을 이용하여 치료될 수 있으나, 이러한 [0003] 치료법이 결핵의 확산을 막기에는 역부족이다. 감염된 개체들은 증상을 나타내지는 아니하나, 일정 기간 보균상태(contagious)일 수 있다. 게다가치료 섭생을 엄격하게 따르더라도 환자의 행동을 통제하는 것은 어렵다. 일부 환자들은 치료과정을 끝마치지 못하는데, 이는 효험없는 치료와 약제 내성의 발달을 초래할 수 있다. 치료의 전 과정을 끝마친다 하더라도, 결핵균 감염은 감염된 개체로부터 근절되지 아니하며 여전히 재활성화될 수 있는 잠복성 감염으로 잔존하게 된다.
[0004] 결핵의 확산을 통제하기 위해서는, 상기 질병에 대한 효과적인 예방접종(vaccination) 및 정확한 초기진단이 가장 중요하다. 현재까지는 생균(live bacteria)을 이용한 예방접종이 보호 면역을 유도하기 위한 가장효율적인 방법이다. 상기 목적을 위해 이용되는 가장 일반적인 마이코박테리움은 바실러스 칼메트-게링(BacillusCalmette-Guerin[0005] , BCG)인데, M. bovis의 비병원성 종이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효능은 논쟁의 대상이 되고 있으며, 미국과같은 일부 국가에서는 상기 제제를 사용한 일반 대중의 예방접종을 실시하지 않고 있다. 결핵의 진단은 일반적으로 피부 검정법을 이용하여 수행되는데, 상기 검정법은 투베르쿨린 PPD(proteinpurified derivative)에 대한피내 노출을 포함한다. 항원-특이 T 세포 반응은 주입후 48-72시간 까지 주입 부위에서의 측정가능한 정도 경화(induration)를 초래하는데, 이는 마이코박테리움 항원에 대한 노출을 의미한다. 그러나 상기 검정법은 민감도및 특이성에서 문제가 있으며, BCG로 예방접종된 개체들은 감염된 개체들과 구별될 수 없다.
[0006] 대식세포는 자연면역이나 염증반응에서 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 획득면역반응에서도 중요한 역할을하는 데, 그 대표적인 기능이 T cell에 항원을 보여주는 것이다(antigen presentation). 대식세포는 식균작용으로 단백질 항원을 받아들이며, 그들을 작은 펩티드(peptide)로 분해하며(antigen processing), 분해된 펩티드(peptide)를 자신의 MHC와 결합시켜 다시 세포표면에 T cell의 활성화를 촉진할 수 있다. 또한 대식세포는 면역반응의 시작에 필요한 항원을 제시하는 기능 이외에도, 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응에서 면역작용을나타내는 중요한 작용세포(effector cell)로 활동하기도 한다. T cell에 의해 활성화된 대식세포는 지연성과민반응(delayed type hypersensitivity)에서 항원을 제거하는 기능을 하며, 대식세포는 항체가 결합되어 있는 항을 식균작용으로 제거하는 기능을 가지고 있다.
[0007] 인터페론 감마를 이용한 대식세포의 항세균제제 사용법의 이론은 간단하다. 즉, 일반적으로 세균에 대한 식균성및 면역성을 가지고 있는 대식세포를 인터페론 감마를 더하여서 그 식균작용 및 면역성을 증가시킨 후 세균과반응시켜 세균에 대한 식균 및 면역성을 더 얻게 만드는 것이다. 이러한 대식세포를 만들기 위해서는 체내에 다량의 인터페론 감마를 투여할 경우 체내 심한 면역독성이 유도됨으로 현 사이토카인을 이용한 항세균요법은 체적용에 많은 문제점을 가지고 있다. 이에 대한 대안으로 세포를 이용한 치료제들이 연구되고 있는 바 수지상포를 이용한 암치료제 연구등이 그것이나 세균에 대한 적용은 미미하다. 이 방법의 원리는 체내에서 혈액 또는 골수를 채취하여 이를 체외에도 배양하여 수지상세포로의 분화를 유도하고 이에 항암항원을 더하여 수지상세포가 항암항원에 대한 면역성을 확보하게 한 후 수지상 세포를 다시 체내에 투입하여 항암면역작용을 유도하는것이다.
선행기술문헌
특허문헌
[0008] (특허문헌 0001) 대한민국 공개특허 제10-2012-0012297호
(특허문헌 0002) 대한민국 공개특허 제10-2012-0090393호
발명의 내용
해결하려는 과제
[0009] 결핵균의 경우 병원성 인자들을 분비함으로써 대식세포(macrophage)의 M1극성화를 방해하는 것으로 알려져 있다. 이는 결국 대식세포의 활성화를 저해시키는바 결핵에 대한 효율적인 치료를 방해하는 문제점이 있어왔다.
이에 본 발명은 대식세포의 극성 조절 또는 극성 조절 가능 물질을 사용하여, [0010] 기존 약제와 작용기전이 다르고부작용이 상대적으로 적은 결핵 예방 및 효율적인 치료 방법을 제공하고자 한다.
과제의 해결 수단
[0011] 전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 M1(전형적인 활성화된 대식세포) 및 M2(대체 활성화 대식세포) 형질을 포함하는 대식세포에 있어서,
[0012] 상기 대식세포를 상기 M1 형질로 극성 유도하여 결핵균의 생존 및 증식을 억제시키기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
[0013] 여기서 상기 극성 유도는 사이토카인에 의하여 수행되며 상기 사이토카인은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다.
[0014] 상기 사이토카인은 지질다당류(Lipopolysaccharide)와 인터페론 감마를 포함하는 것을 특징으로 한다.
[0015] 또한 구체적으로 대식세포의 극성을 활성화시키기 위하여 사용하는 조성물은 지질다당류(Lipopolysaccharide)의양은 1~20ng/ml 또는 인터페론감마의 양은 1~20ng/ml인 것을 특징으로 한다.
[0016] 상기 사이토카인에 항결핵 약제를 병용하여 사용하는 것을 포함할 수 있다.
[0017] 상기 항결핵 약제는 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol), 피라진아미드(Pyrazinamide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
[0018] 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
발명의 효과
[0019] 이상과 같이 본 발명에 의하면 종래 전혀 알려져 있지 않던 대식세포(macrophage) 극성(polarization) 유도에의한 결핵균 억제효과를 증명한 것이므로, 일반적인 결핵균 뿐만 아니라 기존 약제에 대해 다약제 내성이 있는결핵균에 대해서도 예방 및 치료효과를 기대할 수 있다.
[0020] 또한 본 발명에 의하면 세포내에 잠복하고 있는 결핵균의 생장을 억제할 수 있기 때문에 M1 대식세포의 극성(polarization)을 유도할 수 있는 사이토카인 또는 화합물 자극 요법을 단독으로 사용하거나 종래 항결핵 약제와 병용한다면 결핵균 및 다약제 내성이 있는 결핵균에도 더욱 효과적일 것으로 사료된다.
도면의 간단한 설명
[0021] 도 1은 대식세포 내 결핵균 감염 시 대식세포 M1/M2 극성 마커들의 발현을 보여주는 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 단백질 발현 전기영동사진.
도 2A, 2B는 M1/M2 대식세포에서 결핵균 감염으로 유도된 세포자멸사(Apoptosis)을 나타낸 그림.
도 2C는 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포에서 Caspase-3, Bax, Bcl-2의 활성을 보여주는 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 단백질 발현 전기영동사진.
도 2D는 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포를 세포질과 미토콘드리아로 분리한 후, 세포 내 시토크롬C(Cytochrome C)의 이동을 보여주는 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 단백질 발현 전기영동사진.
도 3A, 3B는 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포에서 세포 내 생존한 결핵균 수를 측정한 그래프.
도 3C, 3D, 3E, 3F는 형광현미경을 통해 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포에서 세포 내 결핵균의 생존을 보여주는 그림.
도 4는 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포에서 항결핵 약제 병용 시 세포 내 결핵균 수를 측정한 그래프.
도 5A는 M1/M2 마우스 모델에서 비강을 통한 결핵균 감염 20일 후, 폐 조직에서 CHOP과 Caspase-3의 활성을 보여주는 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 단백질 발현 전기영동사진.
도 5B는 결핵균 감염 M1/M2 마우스 모델의 폐 조직 내에서 생존한 결핵균의 수를 측정한 그래프.
도 5C는 결핵균 감염 M1/M2 마우스 모델에서 항결핵 약제와 병용 시 폐 조직 내에서 생존한 결핵균의 수를 측정한 그래프.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
인터페론 감마는 항원을 만나기 전의 대식세포보다 강력한 항원제시 [0022] 능력을 갖게 한다. 또한 보체를 매개로 하여 탐식능도 키우며 전염증성 사이토카인을 생성하게 한다. 이것을 소위 전형적인 활성화된 대식세포(M1)이라고 한다
[0023] 보조 T림프구는 분비하는 사이토카인에 따라 크게 두 가지 다른 형태로 분류하는데 Th1과 Th2 세포로분류할 수 있다. 이중 IL-4와 같은 Th2 세포에 의해 주로 분비되는 사이토카인은 대식세포를 인터페론 감마에의해 유도되는 활성화와 대조적인 상태, 예를 들면 주조직적합성항원 class Ⅱ의 발현을 증가시킨다. 이런 상태의 대식세포를 일컬어 대체 활성화 대식세포(M2)라고 한다.
[0025] 전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 M1(전형적인 활성화된 대식세포) 및 M2(대체 활성화 대식세포) 형질을 포함하는 대식세포에 있어서,
[0026] 상기 대식세포를 상기 M1 형질로 극성 유도하여 결핵균의 생존 및 증식을 억제시키기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[0027] 여기서 상기 극성 유도는 사이토카인에 의하여 수행되며 상기 사이토카인은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다.
[0028] 상기 사이토카인은 지질다당류(Lipopolysaccharide)와 인터페론 감마를 포함하는 것을 특징으로 한다.
[0029] 또한 구체적으로 대식세포의 극성을 활성화시키기 위하여 사용하는 조성물은 지질다당류(Lipopolysaccharide)의양은 120ng/ml 또는 인터페론감마의 양은 120ng/ml인 것을 특징으로 한다.
[0030] 상기 사이토카인에 항결핵 약제를 병용하여 사용하는 것을 포함할 수 있다.
[0031] 상기 항결핵 약제는 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol), 피라진아미드(Pyrazinamide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
[0032] 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
[0034] 이하 본 발명에 따른 대식세포의 극성(Macrophage polarization)을 이용한 세포 내 결핵균의 생존 및 증식 억제방법의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조로 하여 상세히 설명한다. 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위하여 제공되는 것이다.
[0036] 실시예 1
[0037] 대식세포(macrophage)의 극성이 결핵균 생존 억제에 미치는 영향을 알아보기 위한 in vitro 실험
[0038] 1. 결핵균 감염시 대식세포의 극성이 어떠한 역할을 하는지 확인하는 단계
[0039] 결핵균의 감염 시 대식세포의 극성이 어떠한 역할을 하는지 분석하기 위하여 결핵균을 감염으로 유도되는 대식세포 극성을 확인하였다. 즉, 마우스 유래 대식세포인 Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 세포를 사용하여, 병원성 결핵균(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)과 비병원성 결핵균(M. tuberculosis H37Ra)을 세포당균 수 1의 비율로 감염시킨 후, 시간에 따른 극성 마커들의 발현 정도를 확인하였다.
[0040] 도면에서 1A는 결핵균이 감염된 대식세포에서 M1 대식세포 극성을 나타내는 마커인 phospho-STAT1(p-STAT1)과,M2 대식세포 극성을 나타내는 마커인 phospho-STAT3(p-STAT3), phospho-STAT6(p-STAT6)의 단백질 발현 정도를웨스턴 블로팅 방법으로 확인한 결과이다. 병원성 결핵균이 감염된 대식세포에서는 배양시간이 지남에 따라 M2대식세포 극성을 나타내는 phospho-STAT3와 phospho-STAT6의 발현이 증가하는 것을 보여준다. 반면, 비병원성결핵균이 감염된 대식세포에서는 M1 대식세포 극성을 나타내는 phospho-STAT1의 발현이 증가하는 것을 확인할수 있었다. (도에서 STAT1, STAT3, STAT6는 내부콘트롤, 이하 동일)도 1B, 1C, 1D는 H37Rv 또는 H37Ra이 감염된 대식세포에서 M1 대식세포 극성을 나타내는 [0041] iNOS, NICD, FPR2,RhoA와, M2 대식세포 극성을 나타내는 Arginase 1, KLF4, Rac1의 단백질 발현 정도를 western blot 방법으로확인한 결과이다. 병원성 결핵균이 감염된 대식세포에서는 배양시간이 지남에 따라 M2 대식세포 극성을 나타내는 Arginase 1, KLF4, Rac1의 발현이 증가하는 것을 보여준다. 반면, 비병원성 결핵균이 감염된 대식세포에서는M1 대식세포 극성을 나타내는 iNOS, NICD, FPR2, RhoA의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. (도에서 β-actin은 내부콘트롤, 이하 동일)
[0042] 또한 도1에 표시된 Rv와 Ra는 H37Rv(병원성 결핵균) 또는 H37Ra(비병원성 결핵균)으로 대식세포에 감염시킨 실험입니다. 결핵균의 병원성에 따라 대식세포의 극성이 달라짐을 의미합니다.
[0044] 2. 마우스 유래 대식세포를 M1/M2 극성화하는 단계
[0045] 마우스 유래 대식세포에 지질다당류(Lipopolysaccharide)(10ng/ml)와 인터페론 감마(IFNγ)(10ng/ml)로 24시간동안 자극시켜 M1 대식세포를, IL-4(10ng/ml)와 IL-13(10ng/ml)을 24시간 동안 자극시켜 M2 대식세포를 준비하였다.
[0047] 3. 결핵균을 상기 대식세포에 감염시킨 후 세포자멸사의 유도를 확인하는 단계
[0048] 도 2A는 결핵균을 감염시킨 M1/M2 대식세포에 Annexin-V/PI 염색한 후, FACS를 이용하여 세포자멸사를 확인하였다. 도 2B는 Annexin-V+/PI- 세포의 비율을 그래프로 나타낸 그림이다. 결핵균 감염 시 M2 대식세포 보다 M1 대식세포에서 현저히 높은 비율로 세포자멸사가 유도되는 것을 알 수 있었다. 도 2C는 결핵균 감염된 M1/M2 대식세포에서 Caspase-3, Bax, Bcl-2를 이용하여 세포자멸사의 유도를 확인하였다. 위의 결과와 마찬가지로, M1 대세포에서 Caspase-3와 Bax의 발현이 증가되어있는 반면에, Bcl-2의 발현은 감소되어있었다.
[0050] 4. 결핵균을 상기 대식세포에 감염시킨 후 시토크롬 C의 세포 내 이동을 확인하는 단계
[0051] 도 3D는 결핵균 감염된 M1/M2 대식세포를 세포질과 마이토콘드리아로 분리한 후, 시토크롬 C의 세포 내 이동을확인한 결과이다. 결핵균 감염 시 M1 대식세포에서 마이토콘드리아에서 세포질로 시토크롬 C 이동이 증가하는것을 확인하였다. (도에서 α-tubulin은 세포질 콘트롤, COX IV는 마이토콘드리아 콘트롤)
[0052] 본 발명자들의 선행발표에 따르면, 대식세포 내 결핵균에 의해 유도되는 세포자멸사는 세포 내 결핵균 생존 억제에 중요한 메커니즘으로 보고한 바 있다. 따라서 상기 실험결과로부터 결핵균 감염 시 M1 대식세포가 세포자멸사를 유도하여 결핵균 증식억제에 더욱 효과적임을 알 수 있다.
[0054] 실시예 2
[0055] 대식세포 극성 조절 물질과 항결핵 약제 병용에 의한 경우
[0056] 1. 결핵균 감염시 대식세포의 극성이 어떠한 역할을 하는지 분석하기 위한 실험.
[0057] 결핵균 감염시 대식세포의 극성이 어떻나 역할을 하는지 분석하기 위하여 M1/M2 대식세포 내의 결핵균의 수를측정하였다.
[0058] 도 3A, 3B는 M1/M2 대식세포에 병원성 결핵균, 비병원성 결핵균을 각각 감염 3시간 후, 시간 후, 세포 외 결핵균을 세척하고 완전배지조건 하에서 24, 48시간 동안 배양한 결과를 나타낸 그래프이다. 세포 내 생존하고 있는결핵균의 수를 확인하기 위해 7H10 agar배지에서 세포를 14~21일 동안 배양하여 전체 생균 수를 산출하였다. 도3C, 3E는 감염 48시간 후, M1/M2 대식세포 내 생존하는 결핵균을 형광현미경으로 나타낸 그림이며, 이를 도 3D,3F에서 그래프로 나타내었다. 결핵균 감염 시 M2 대식세포 보다 M1 대식세포에서 결핵균의 제어가 효과적으로일어나는 것을 확인할 수 있었다.
[0060] 2. 대식세포 극성 조절 물질과 항결핵 약제 병용에 의한 결핵균 생존 억제 효과에 대한 확인을 위한 실험
[0061] 도 4는 대식세포에 결핵균 감염 3시간 후, 세포 외 결핵균을 세척하고 항결핵 약제(Rifampicin:RIF,Ethambutol:EMB, Isoniazid:INH, Pyrazinamide:PZA) 처리 또는 항결핵 약제와 M1/M2 대식세포 극성 유도 물질(LPS+IFNγ 또는 IL-4+IL-13)을 함께 처리하고 24, 48시간동안 배양한 다음 세포 내 결핵균의 수를 측정하였다.
실험 결과, 항결핵 약제 단독 처리 시 결핵균의 균수가 감소하였으며, 특히 M1으로 극성을 유도한 세포에서 결핵균의 생존이 더욱 효율적으로 억제되는 것을 확인하였다. 반면, 항결핵 약제 처리에도 불구하고 M2 대식세포에서는 결핵균 생존 억제가 효과적으로 이뤄지지 않은 것을 보였다.
다만, 항결핵 약제 처리 자체가 결핵균 생존 억제를 보인다는 것은 [0062] 이미 알려진 바이므로 따로 그래프에 넣지 않았습니다. 항결핵 약제 단독처리보다는 M1/M2 극성에 따른 결핵균 사멸효과를 집중하여 설명하고자하였습니다. 따라서 항결핵 약제 처리 시 M1 대식세포에서는 결핵균 사멸효과가 더욱 뛰어난 반면, M2 대식세포에서는 약제에 대한 사멸기능이 상대적으로 감소되어 있다는 것을 본 실험에서는 강조하고자 하였습니다. 그러므로 상기의 M1대식세포의 심험결과와 이미 공지된 사실인 항결핵 약제의 결핵균 생존 억제의 사실을 바탕으로항결핵 약제와 대식세포 극성 조절을 함께 해주면 결핵균 사멸에 더욱 효과적일 것이라 판단하였습니다.
[0063]
[0064] 실시예 3
[0065] 대식세포의 극성이 결핵균 생존 억제에 미치는 영향을 알아보기 위한 in vivo 실험(마우스 모델 대상)
[0066] 1. 마우스 유래 대식세포를 M1/M2 극성화하는 단계.
[0067] 마우스 유래 대식세포에 지질다당류(Lipopolysaccharide)(10ng/ml)와 인터페론 감마(IFNγ)(10ng/ml)로 24시간동안 자극시켜 M1 대식세포를, IL-4(10ng/ml)와 IL-13(10ng/ml)을 24시간 동안 자극시켜 M2 대식세포를 준비하였다.
[0069] 2. 상기 대식세포를 결핵균에 감염시킨 후 대식세포의 극성이 결핵균 생존 억제에 미치는 영향을 알아보기 위한실험.
[0070] 도 5A는 M1/M2 마우스 모델을 결핵균으로 비강 감염시키고, 감염 20일 후 M1/M2 마우스 모델의 폐 조직에서CHOP과 Caspase-3 단백질 발현 정도를 웨스턴 블로팅 방법으로 확인한 결과이다. M2 마우스 모델보다 M1 마우스모델의 폐 조직에서 세포자멸사 활성이 현저히 높은 것을 관찰할 수 있었다. 도 5B는 결핵균 감염 3, 7, 20일후 M1/M2 마우스 모델의 폐 조직 내에서 생존한 결핵균의 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도5B는 M1/M2마우스 모델에 결핵균 감염시킨 후, 음수(1.5ml/10g 마우스 체중)를 통해 항결핵 약제 10 mg/kg (RIF, EMB,INH, PZA mixture)를 섭취시켜주었다. 결핵균 감염 3일 후 M1/M2 마우스 모델의 폐 조직 내에서 생존한 결핵균 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 항결핵 약제 섭취 시에도 마우스 모델보다 M2 마우스 모델의 폐 내에서 결핵균의 생존이 유리한 것을 확인할 수 있었다. in vitro. 결과와 마찬가지로, in vivo. 실험에서도 결핵균 감염 시 M1 마우스 모델에서 세포자멸사를 유도하여 결핵균 증식억제에 더욱 효과적일 것으로 사료된다.
[0071] 상기 실시예에서는 결핵균의 병원성에 따라 대식세포의 극성이 조절되며, 결핵균 감염 시 M1으로 극성화시킨 대식세포가 세포자멸사를 이용한 세포 내 결핵균의 생장을 억제하는 능력이 현저히 높은 것을 확인하였다. 반면, M2 대식세포는 세포 내 결핵균의 생존에 유리한 환경이므로, 병원성이 강한 결핵균일수록 M2 대식세포로 극성을 유도한다. 본 결과는 대식세포의 극성을 조절함으로써 세포 내 결핵균 생존 제어가 가능하다는 것을 나타내는 증거이다.
【심사관 직권보정사항】
【직권보정 1】
【보정항목】청구범위
【보정세부항목】제3항
【변경전】
상기 사이토카인
【변경후】
상기 인터페론 감마, IL-4 및 IL-13
【직권보정 2】
【보정항목】청구범위
【보정세부항목】제5항
【변경전】
제4항에 있어서,
【변경후】
제2항에 있어서,
