아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물

청구범위
청구항 1
하기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
청구항 2
제1항에 있어서,상기 아우랍텐은 저산소유도인자-1α(HIK-1α, hypoxia-inducible factor-1α)를 억제하는 것을 특징으로 하는신장암의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 3
하기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암세포 전이억제용 조성물.
[화학식 1]
청구항 4
제3항에 있어서,상기 아우랍텐은 저산소유도인자-1α(HIK-1α, hypoxia-inducible factor-1α)를 억제하는 것을 특징으로 하는신장암세포 전이억제용 조성물.
청구항 5
하기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
청구항 6
제5항에 있어서,상기 아우랍텐은 저산소유도인자-1α(HIK-1α, hypoxia-inducible factor-1α)를 억제하는 것을 특징으로 하는신장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
청구항 7
하기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암세포 전이억제용 건강기능식품.
[화학식 1]
청구항 8
제7항에 있어서,상기 아우랍텐은 저산소유도인자-1α(HIK-1α, hypoxia-inducible factor-1α)를 억제하는 것을 특징으로 하는신장암세포 전이억제용 건강기능식품.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 [0001] 것이며 또한, 본 발명은 아우랍텐을포함하는 신장암세포 전이억제용 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 신장암(renal cell carcinoma)은 대부분 신장에서 소변을 만드는 세포들이 모여 있는 부분인 실질(수질과 피질로 구성)에서 발생하는 신장세포 암을 의미한다. 미국에서는 성인암의 3%를 차지하며, 연간 약 32,000명 정도의환자가 발생하고, 약 12,000명 정도가 신세포암으로 인해 사망하는 것으로 추정되고 있다. 또한, 신장암은 매년 세계적으로 그 발생빈도가 증가하고 있으며, 우리나라의 경우에는 60~70대의 노년층에서 주로 발생하고, 남성에서 발생하는 암 중 2.0%로 10위, 여성에서는 1.2%로 15위를 차지하고 있다.
[0003] 신장암의 치료를 위해, 다른 기관으로 전이되지 않은 경우에는 신장과 그 주위 정상 조직을 광범위하게 절제하는 수술을 하거나, 종양이 크지 않은 경우에는 복강경을 이용하여 절제 수술을 하며, 신장암이 다른 한 장기로만 전이된 경우에는 종양만을 제거한다. 그 외의 치료 방법으로는 면역요법, 호르몬요법, 항암 화학요법, 방사선요법 등이 있지만, 치료 효과는 크지 않은 것으로 알려져 있어, 아직까지는 외과적 수술 이외에는 확실한 효과가 있는 치료법이 없다는 것이 신장암 치료에 대한 문제이다.
[0004] 한편, 암 중에서도 특히 고형암에서의 저산소증은 일반적으로 나타나는 현상으로서, 고형암세포들은 대게 다양
한 유전적 변화를 거쳐 저산소 조건에 적응되므로 암세포는 더욱 악성화 될 뿐만 아니라 항암제에 대한 내성도갖게 된다. 또한, 저산소증은 인간의 모든 암에 있어서 70% 이상의 암을 악성화 시키는 주요 유발인자로 알려져있다(Bos, R. et al., 2003; Hockel, M. et al., 2001; Kung, A. L. et al., 2000; Maltepe, E. et al.,1997).
[0005] 저산소유도인자-1(HIF-1, hypoxia inducible factor-1)은 저산소 조건에서 암세포의 적응을 조절하는 가장 중요한 인자로, 외부의 산소 농도의 변화에 적절하게 반응하기 위해 해당과정, 혈관신생 등을 유도함으로써 세포내항상성을 유지시켜주는 전사 인자이다(Semenza, G. L., 2003). 그 중에서, HIF-1α는 basix helix-loophelix/Per-Arnt-Sim(bHLH/PAS)구조를 지니며, 저산소 조건이나 유전적 결함에 의한 암세포 내 HIF-1α의 발현증가 및 활성 증가의 조건은, HIF-1α의 의존적 신호전달을 활성화시켜 종양 세포의 증식을 유도하고 혈관신생을 촉진할 뿐만 아니라 항암제에 대한 내성 및 암세포 전이도 촉진하는 것으로 알려져 있다(참고도 1). 따라서HIF-1은 고형암의 성장, 증식 및 악성화에 있어 중요한 역할을 담당하므로 이를 타겟으로 하는 항암제에 대한연구가 매우 활발히 진행되고 있다(Rapisarda, A. et al., 2002; Semenza G. L., 2003).
[0006] [참고도 1]
[0007]
[0008] 아우랍텐(auraptene)은 쿠마린류 화합물의 일종이며 감귤류로부터 분리 확인된 성분으로 항암 활성, 항산화 활성, 항염증 작용, PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor) 아고니스트 활성, 항균 활성, 항혈소판활성, 항리슈마니아 활성 등의 생리 활성이 알려져 있다.
[0009] 또한, 아우랍텐(auraptene)과 관련된 선행문헌으로는 암세포에서 HIF-1 신호전달 방해를 통한 항암작용(Li, J.et al., 2013), 대장암에 대한 효과(Epifano, F. et al., 2013), 흑색종 암세포의 폐로의 전이억제 효과(Tanaka, T. et al., 2000; Barthomeuf, C. et al., 2008), 암세포 전이억제에 대한 효과(미국특허공개009/0118361, 2009) 및 HIF-1 억제를 통한 신장암 치료 효과(Razorenova, O.V. et al., 2014) 등이 보고되어있으나, 현재까지 아우랍텐이 신장암세포에 대한 선택적인 항암작용의 효과가 있음은 아직 알려지지 않는 상황이다.
[0010] 이에 본 발명자들은 미토콘드리아 억제제로 알려져 있는 감귤류 추출물인 아우랍텐(auraptene)을 이용하여, 암의 대사와 전이의 주요 조절인자인 저산소유도인자-1α(HIF-1α, hypoxia inducible factor-1α)를 선택적으로억제하여 신장암의 예방 또는 치료효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
선행기술문헌
특허문헌
[0011] (특허문헌 0001) 미국특허공개 US 2009/0118361, suppressor of expression of MCP-1, and amelioratingagent for inflammatory disease, pharmaceutical, supplement, food, beverage of food additive using the suppressor, 2009년 5월 7일 공개.
비특허문헌
[0012] (비특허문헌 0001) Barthomeuf, C. et al., Umbelliprenin from Ferula szowitsiana inhibits the growth ofhuman M4Beu metastatic pigmented malignant melanoma cells through cell-cycle arrest in G1 andinduction of caspase-dependent apoptosis, Phytomedicine, 15(12), 103-111, 2008.
(비특허문헌 0002) Bos, R. et al., Levels of hypoxia-inducible factor-1alpha independently predictprognosis in patients with lymph node negative breast carcinoma, Cancer, 97(6), 1573-1581, 2003.
(비특허문헌 0003) Epifano, F. et al., Auraptene and its effects on the re-emergence of colon cancerstem cells, Phytother. Res., 27(5), 784-786, 2013.
(비특허문헌 0004) Hockel, M. et al., Biological consequences of tumor hypoxia, Semin Oncol., 28, 36-41, 2001.
(비특허문헌 0005) Kung, A. L. et al., Suppression of tumor growth through disruption of hypoxiainducibletranscription, Nature Med., 6(12), 1335-1340, 2000.
(비특허문헌 0006) Li, J. et al., Semisynthetic studies identify mitochondria poisons from botanicaldietary supplements-geranyloxycoumarins from Aegle marmelos, Bioorg. Med. Chem., 21(7), 1795-1803,2013.
(비특허문헌 0007) Razorenova, O. V. et al., The apoptosis repressor with a CARD domain (ARC) gene isa direct hypoxia-inducible factor 1 target gene and promotes survival and proliferation of VHLdeficientrenal cancer cells, Mol. Cell. Biol., 34(4), 739-751, 2014.
(비특허문헌 0008) Rapisarda, A. et al., Identification of small molecule inhibitors of hypoxiainduciblefactor 1 transcriptional activation pathway, Cancer Res., 62(15), 4316-4324, 2002.
(비특허문헌 0009) Semenza G. L., Targeting HIF-1 for cancer therapy, Nat. Rev. Cancer., 3(10), 721-732, 2003.
(비특허문헌 0010) Tanaka, T. et al., Suppressing effects of dietary supplementation of theorganoselenium 1,4-phenylenebis(methylene)selenocyanate and the Citrus antioxidant auraptene on lungmetastasis of melanoma cells in mice, Cancer Res., 60(14), 3713-3716, 2000.
(비특허문헌 0011) Maltepe, E. et al., Abnormal angiogenesis and responses to glucose and oxygendeprivation in mice lacking the protein ARNT, Nature, 386(6623), 403-407, 1997.
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 목적은 아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물 [0013] 또는, 신장암세포의 전이억제용 조성물을 제공하는 데에 있다.
과제의 해결 수단
[0014] 본 발명은 하기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[0015] [화학식 1]
[0016]
[0017] 상기 아우랍텐은 저산소유도인자-1α(HIF-1α, hypoxia inducible factor-1α)를 억제하는 효과가 있다.
[0018] 또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암세포의 전이억제용 조성물에 관한 것이다.
[0019] 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1의 아우랍텐(auraptene)을 포함하는 신장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
[0020] 이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
[0021] 본 발명은 아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 저산소유도인자-1α를 선택적으로 억제하여 사용될 수 있다.
[0022] 또한, 본 발명은 아우랍텐을 포함하는 신장암세포의 전이억제용 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 신장암세포의 이동성을 저해하는 전이억제용 조성물에 관한 것이다.
[0023] 한편, 본 발명의 아우랍텐은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.
[0024] 또한, 본 발명은 아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하며, 상기 아우랍텐을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트,탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 아우랍텐에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제,예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액,비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
[0025] 본 발명의 아우랍텐을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[0026] 본 발명의 아우랍텐을 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 아우랍텐은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
[0027] 또한, 본 발명은 아우랍텐 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 신장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 아우랍텐은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 아우랍텐을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.
발명의 효과
[0028] 본 발명은 아우랍텐을 포함하는 신장암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이며 상기 아우랍텐은 신장암세포에서 저산소유도인자-1α를 선택적으로 억제하는 효과 및 신장암세포의 이동성을 저해하는 효과가 우수하여 신장암의 예방 또는 치료용 조성물 및 신장암세포의 전이억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0029] 도 1은 본 발명의 아우랍텐이 해당과정과 미토콘드리아 대사를 억제시키지만 세포 성장에는 영향을 주지 않음을나타내는 산소소비율(도 1A) 및 세포 성장(도 1B)의 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 아우랍텐이 신장암세포에 대해 선택적(도 2A)이고, 처리 농도(도 2B) 및 시간(도 2C) 의존적으로 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 효과가 있음을 나타내는 웨스턴 블럿 결과이다.
도 3은 본 발명의 아우랍텐이 HIF-1α 단백질 발현을 억제하는 효과가 있음을 나타내는 면역 형광법 염색 결과이다.
도 4는 본 발명의 아우랍텐이 신장암세포의 이동을 농도 의존적으로 저해하는 효과(도 4A) 및 이를 수치화한 그래프(도 4B)이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 [0030] 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
[0031] <실시예 1. 아우랍텐의 산소소비율 및 세포 성장 확인>
[0032] 본 발명의 아우랍텐이 해당과정과 미토콘드리아 대사를 억제시키지만 세포 성장에는 영향을 주지 않음을 확인하기 위해 산소소비율(OCR, oxygen consumption rate) 및 세포 성장을 측정하였다.
산소소비율을 측정하기 위해, RCC4(Renal cell carcinoma 4)를 24웰 OCR 플레이트에 5×103
[0033] 세포/웰의 농도로 분주한 뒤 DMSO(대조군) 또는 10μM의 아우랍텐(Sigma-Aldrich, USA)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후,미토콘드리아 ATP 합성 억제제(mitochondrial ATP synthase inhibitor)인 올리고마이신(oligomycin, Sigma-Aldrich, USA) 2㎍/㎖, 미토콘드리아성 짝풀림제(mitochondrial uncoupler)인 CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, Sigma-Aldrich, USA) 5μM 및 미토콘드리아 복합체Ⅰ 억제제(mitochondrial complexⅠinhibitor)인 로테논(rotenone, Sigma-Aldrich, USA) 2μM을 순차적으로 더한 뒤, XF24 분석기(seahorse, MA,USA)로 산소소비율을 측정하여 도 1A에 나타내었다.
[0034] 또한, 아우랍텐의 RCC4 세포에서의 세포 성장을 측정하기 위해, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 실시하였다. 먼저, RCC4 세포를 10%[v/v] FBS(fetal bovine serum,Gibco, Rockville, MD, USA)와 1%[v/v] 페니실린/스트렙토마이신(100U/㎎, Sigma-Aldrich Co., USA) 및 100㎍/㎖의 G418(Sigma-Aldrich, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 넣고 96웰 플레이트(96well microtiter plate)의 각 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해된 아우랍텐을 처리하지 않은 군 및25 내지 100μM로 처리한 군을 37℃, 5% CO2와 대기습도가 유지되는 조건에서 6 내지 24시간 동안 배양하였다.
이후, 상기 배양액을 제거하고 MTT 용액이 포함된 혈청이 없는 배지를 더하여 1시간 동안 반응한 뒤, 생성된 포르마잔 결정을 DMSO로 용해시켜 Multiskan Ascent plate reader(thermo scientific, MA, USA)로 570㎚에서 흡광도를 측정하여 도 1B에 나타내었다.
[0035] 도 1의 결과를 참고하면, 본 발명의 아우랍텐이 RCC4 세포의 미토콘드리아 호흡을 크게 감소하는 효과를 나타낸다. 그러나 암세포는 미토콘드리아의 호흡보다는 해당과정을 통한 대사 작용을 선호하므로 본 발명의 아우랍텐농도에 관계없이 세포 성장에는 영향을 주지 않아 세포독성이 없음을 확인 할 수 있다.
[0036] <실시예 2. HIF-1α 단백질 발현의 억제 효과 확인>
[0037] 본 발명의 아우랍텐이 HIF-1α 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 웨스턴 블럿(western blot) 및 면역 형광법 염색(immunofluorescence staining) 을 실시하였다.
[0038] 실시예 2-1. HIF-1α 단백질 발현의 억제 효과 확인 - 웨스턴 블럿
[0039] 웨스턴 블럿을 이용한 단백질 발현의 측정을 위해, 각각의 MEFs(Murine embryonic fibroblasts, Cefobio,Korea), HepG2(human hepatic carcinoma, ATCC, MD, USA), MCF-7(human breast cancer, ATCC, MD, USA) 및RCC4(ECACC, Salisbury, UK)세포를 하기 조건에 따른 각 배지에 넣고 37℃에서 5% CO2와 21% O2 조건에서 배양하였다.
[0040] * 각 세포의 배지 조건
[0041] MEFs : DMEM + 15%[v/v] FBS;
[0042] HepG2 : DMEM + 10%[v/v] FBS + 1%[v/v] 페니실린/스트렙토마이신(100U/㎎);
MCF-7 : DMEM + 10%[v/v] FBS + 1%[v/v] 페니실린/[0043] 스트렙토마이신(100U/㎎);
[0044] RCC4 : DMEM + 10%[v/v] FBS + 1%[v/v] 페니실린/스트렙토마이신(100U/㎎) + 100㎍/㎖의 G418.
[0045] 상기 배양된 세포를 프로테아제 저해 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche, switzerland)이 포함된(대조군의 경우 포함되지 않음) RIPA 완충액(50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%[v/v] Nonidet P-40, 0.5%[w/v]deoxycholate, 0.1%[w/v] SDS)으로 용해하고, 상기 용해물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)에 로딩(loading)하여 전기영동을 실시하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulosemembrane, Pall corporation, USA)으로 전이시켰다. 상기 단백질이 전이된 멤브레인에 각각의 항-HIF-1α(Novus biologicals, USA), 항-래빗 β-actin(Santa Cruz biotechnology, USA), 항-α-tubulin(Sigma-Aldrich) 1차 항체와 HRP(horseradish peroxidase)-항-마우스 IgG(Pierce biotechnology, USA) 또는 항-래빗IgG(Calbiochem, USA)를 2차 항체로 사용하고, ECL 시스템(enhanced chemiluminescence system, Amershambiosciences, England)으로 단백질을 확인하여 도 2A 내지 2C에 나타내었다.
[0046] 도 2를 참고하면, 본 발명의 아우랍텐이 MEFs, HepG2, MCF-7세포에서와는 달리, 신장암세포(RCC4)에서만 선택적으로 발현되는 HIF-1α의 단백질 발현을 감소하는 효과(도 2A)를 나타낸다. 또한, 상기 아우랍텐의 처리 농도(도 2B) 및 시간(도 2C) 의존적으로 HIF-1α 단백질 발현을 감소하는 효과를 나타내어 신장암의 예방 또는 치료용 조성물로서의 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[0047] 실시예 2-2. HIF-1α 단백질 발현의 억제 효과 확인 - 면역 형광법 염색
[0048] 면역 형광법 염색을 위해, RCC4 세포를 커버 슬립(cover slip)에 에탄올 및 질산 용액을 함께 처리하였다.
이후, 100μM의 아우랍텐을 처리하여 24시간 반응하고, 4%[v/v] 파라포름알데히드로 실온에서 15분 동안 고정한뒤, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 0.25%[v/v] 트리톤(triton) X-100으로 10분간 삼투(permeabilize)하였다. 상기 세포를 PBS에 용해한 항-마우스 HIF-1α 항체(BD Transduction, USA)를 더해 4℃에서 16시간 동안 반응하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, PBS에 희석된 항-마우스(Alexa Fluor 488이 결합)2차 항체를 더하여 실온에서 1시간 동안 반응한 뒤, 세포를 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole, LifeTechonologies, USA)로 실온에서 5분간 염색하여 HIF-1α 및 DAPI를 LSM 510 META 현미경(Carl Zeiss AG,Jena, Germany)으로 관측하여 도 3에 나타내었다.
[0049] 도 3을 참고하면, 본 발명의 아우랍텐이 신장암세포에서만 선택적으로 발현되는 HIF-1α의 단백질 발현을 감소하는 효과를 나타내어, 신장암의 예방 또는 치료용 조성물로서의 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[0050] <실시예 3. 아우랍텐의 신장암세포 이동성 억제 효과 확인>
[0051] 본 발명의 아우랍텐이 신장암세포의 이동성에 미치는 영향을 확인하기 위해 상처 치유 어세이(wound healingassay)를 실시하였다.
[0052] RCC4 세포(ECACC, Salisbury, UK)층을 파이펫 팁으로 긁은(scratch) 뒤 배지로 세척하여 제거한 다음, 아우랍텐을 처리하지 않은 군 및 50 내지 100μM으로 아우랍텐을 처리한 군을 24시간 반응하였다. 이후, 긁힌 부분을제외하고 남아있는 세포들의 이동성을 확인하기 위해 긁힌 공간의 수평 거리를 측정하여 도 4A 및 4B에 나타내었다.
[0053] 도 4를 참고하면, 본 발명의 아우랍텐이 신장암세포의 이동성을 농도 의존적으로 저해하는 효과를 나타내어 신장암세포 전이억제용 조성물로서의 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[0054] <실시예 4. 독성실험>
[0055] 실시예 4-1. 급성독성
[0056] 본 발명의 아우랍텐을 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스를 20마리를 준비하였고, 각 군별로 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 본 발명의 아우랍텐을.0g/㎏의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 상기 아우랍텐을 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.
[0057] 실시예 4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험
[0058] 장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의아우랍텐을 1.0g/㎏의 농도로 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(vitalscientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다.
또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으나 특이한 이상은 관찰되지 않았다.
[0059] <제제예 1. 약학적 제제>
[0060] 제제예 1-1. 정제의 제조
[0061] 본 발명의 아우랍텐 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
[0062] 제제예 1-2. 주사제의 제조
[0063] 본 발명의 아우랍텐 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
[0064] <제제예 2. 식품 제조>
[0065] 제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
[0066] 본 발명의 아우랍텐을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
[0067] 제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
[0068] 본 발명의 아우랍텐을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
[0069] 제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
[0070] 본 발명의 아우랍텐을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
[0071] 제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
[0072] 본 발명의 아우랍텐을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한유제품을 제조하였다.
[0073] 제제예 2-5. 야채주스 제조
[0074] 본 발명의 아우랍텐 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
[0075] 제제예 2-6. 과일주스 제조
[0076] 본 발명의 아우랍텐 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.