전복 내장 유래의 항알러지 효과를 가지는 펩타이드가 함유된 약학 조성물

본 발명은 항알러지 효과를 갖는 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전복(Haliotis discus hannai) 내장에서 유래된 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser으로 구성된 기능성 펩타이드에 관한 것으로,항알러지 효과를 가지는 펩타이드는 활성화된 인간 비만세포에서 유도되는 알러지 반응을 억제할 수 있는 뛰어난 효과를 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알러지 반응 관련 질환에 유용하게 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

청구범위
청구항 1
전복 내장(haliotis discus hannai)을 위 소화조건에서 가수분해하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 가수분해물중 AIGID 분획물을 수득하는 단계와; 상기에서 얻은 AIGID 분획물로부터 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 동정하는 단계를 포함하는 것이 특징인 전복 내장 유래의 펩타이드 제조법.
청구항 2
제 1항의 방법에 따라 제조된 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser의 아미노산 서열로 구성된 전복내장 유래의 펩타이드.
청구항 3
제 2항의 전복 내장 유래의 펩타이드가 함유된 아토피, 천식, 피부 알러지 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
청구항 4
제 3항에 있어서, 상기 조성물은 희석제, 감미제, 안정제, 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 약학적으로 용인가능한 담체 또는 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 5
제 3항의 조성물은 정제(tablet), 캡슐(capsule), 드라제(dragee), 비드(bead), 과립(granule), 용액(solution), 현탁액(suspension) 또는 사쉐(sachet) 중 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 항알러지 효과를 갖는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전복(Haliotis [0001] discus hannai) 내장유래의 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser으로 구성된 항알러지 기능성 펩타이드가 함유된 항알러지 반응 관련 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 전복은 고대부터 우수성을 인정받은 우리나라 전복에 대한 효능은 한의학 서적인 명의별람(名醫別監)이나 규합총서(閨閤叢書) 등에서는 "몸을 가볍게 하고 눈을 밝게 하는 전복의 효능"을 명기하고 있다. 조선시대 석학 정약전은 자산어보에서 전복을 복어라는 이름으로 소개하면서 '살코기는 맛이 달아서 날로 먹어도 좋고, 익혀 먹어도 좋지만 가장 좋은 방법은 말려서 포를 만들어 먹는 것이다. 그 장은 익혀 먹어도 좋고, 젓갈을 담가 먹어도 좋으며, 종기 치료에 효과가 있다. 봄과 여름에는 독이 있는데 이 독에 접촉하면 살이 부르터 종기가 되고환부가 터진다."라고 기록했다. 일반적으로 패류는 피로한 신경을 회복시키는 작용이 뛰어나다. 그중에서도 전복은 눈이 침침하고 빽빽한 시신경 피로 증세를 가라앉히는 데 탁월한 효능이 있다. 전복의 껍질은 한방에서도석결명(石決明)이라하여 결막염과 백내장 등에 요긴하게 쓰이고 있다. 또 목이 타거나 가슴이 저며오는 증상을해소하고 간장 기능을 강화하며, 몸이 허약할 때 전복을 끓여 먹으면 기운이 나며, 소변이 잘 나오게 되고, 황달이나 방광염에도 도움이 된다.
전복은 배설물조차 영양가치가 뛰어나 당뇨병과 고혈압 치료제로 사용되기도 [0003] 한다. 전복에는 단백질이 풍부하여그것을 구성하는 아미노산이 다양하고 인, 철, 요오드 등 미네랄과 비타민도 풍부하다. 그래서 전복은 예로부터고급 수산물로 취급되었는데, 피부미용, 자양강장, 산후조리, 허약체질 등에 탁월한 효능이 있어 식용뿐만 아니라 약용을 목적으로 드시는 사람도 많다.
[0004] 사람이 요오드와 갑상선 호르몬이 부족하면 기초대사 둔화로 인한 비만이나, 지방의 혈관 내 축적 현상 등이 나타날 수 있다. 뿐만 아니라 갑상선 호르몬은 성장기의 어린이들의 육체적, 정신적, 성적 성장에 관여한다. 요오드가 부족하면 중요한 갑상선 기능 저하증이 생길 수 있으며, 피부가 거칠어지고, 모발이 가늘어진다. 따라서해조류 같은 식품으로 요오드를 섭취하는 것이 안전한 방법이다. 전복은 요오드 함량이 높다. 머리가 아프거나울리며 혀와 목이 마르는 증세가 있을 때 전복을 먹으면 신기하게 낫기 때문에 간의 힘을 키워준다고 알려져 있다. 옛날부터 산후 7일 안에 산모의 젖이 나오지 않을 때 전복을 고아 먹이면 큰 효과를 본다고 전해지고 있는데, 이는 전복에 미네랄이 많기 때문이다. 또 전복은 고단백 성분이라 체내 흡수율이 높아서 임산부, 비만증,간 경화증에도 좋은 식품이다. 그래서 간기능 회복과 폐결핵의 약으로 쓰이기도 한다. 전복에는 메티오닌과 시스테인 등 황함 아미노산이 풍부해 병을 앓은 뒤의 원기회복과 피로회복에 좋다. 전복에 관한 연구는 양식기술및 육종개발 차원에서 주로 수행돼 왔으며, 최근 내장(intestine)으로부터 효소 및 렉틴(lectin)과 같은 기능성에 대한 연구가 진행되고 있다. 또한, 전복에 대한 생리활성에 대한 연구는 육부위(flesh tissue)와 내장(intestine)의 추출물에 대한 항산화, 항고혈압 등에 관한 연구가 부분적으로 수행되었지만, 더욱 다양한 생리성 및 작용기전에 대한 연구는 미비한 상태이다.
[0005] 알러지는 면역 불균형에 의한 과민반응의 일종으로 알러젠(allergen)이라는 특정한 항원에 대하여 나타나는 반응으로 그 항원에 대해 특이적인 IgE 항체가 비만세포(mast cell)나 호염구(basophile)에 결합하여 유도되는 반응이다. 상기 IgE 항체에 의해 활성화된 비만세포나 호염구는 염증성 사이토카인 및 히스타민 등을 분비하여 혈관확장 및 염증반응을 일으켜 알러지성 아토피, 천식, 피부알러지 등을 일으킨다. 심한 경우 국소적으로는 염증포들의 침윤이 일어나는 염증반응이며 제 1형 과민반응에 속한다. 이러한 알러지 질환은 발병률이 크게 증가되어 그에 따른 질환 완화 및 예방에 대한 중요성이 부각되고 있다. 그러나 기능성 식품에서 의약품을 통틀어스피루리나가 면역활성 건강식품 소재로 활용되는 것 외에는 해양 천연물 유래 면역활성 소재와 관련 기술 개발은 거의 전혀 없는 상태이다.
[0006] 본 발명의 선행기술로는 MMP 활성 억제 효과를 갖는 전복 내장 위장관 소화가수분해물 및 이를 유효성분으로함유하는 약학 조성물이 대한민국 등록특허 제10-2013-0029597호에 공지되어 있으나 이는 전복 내장 위장관소화수분해물(AIGID)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 전복의 효능과 기능 등은 오래전부터 사용된 민간요법과 일부 고대문헌에 알려져 있지만 이러한 사실을 과학적 사실에 기반을 두어 입증한 자료는 지금까지 전무한 실정이어서 보다 과학적이고 실증적인 연구를 통해 전복의 효능의 입증과 재평가가 시급한 과제이다.
발명의 내용
해결하려는 과제
[0007] 본 발명의 목적은 전복 내장 유래의 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala- Ser의 아미노산 서열로 구성된 항알러지 기능성 펩타이드를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드가 함유된 알러지 질환 예방 및치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
과제의 해결 수단
[0008] 본 발명의 상기 목적은 전복(haliotis discus hannai) 내장을 위 소화조건에서 가수분해하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 가수분해물중에서 AIGID 분획물을 수득하는 단계와; 상기 AIGID 분획물로부터 Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 동정하는 단계와; 상기 단계에서 확인한 펩타이드를 인간 비만세포에서 유래한 알러지 효과를 억제하는 효과를 평가하는 단계로; 이루어지고 상기 펩타이드가 함유된알러지 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공함으로써 달성하였다.
발명의 효과
본 발명 전복 내장으로부터 정제된 펩타이드는 인간 비만 세포에서 알러지 [0009] 반응을 억제하는 효과를 나타내는 효과가 있고, 이를 유효성분으로 함유된 약학적 조성물은 알러지 반응 관련 질환의 예방 및 치료에 뛰어난 효과가있다.
도면의 간단한 설명
[0010] 도 1은 본 발명에 따라 전복 내장 유래 가수분해물로 분자량과 아미노산 서열을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 전복 내장 유래 가수분해물이 인간 비만 세포에 나타나는 독성 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 전복 내장 유래 가수분해물이 인간 비만 세포에 히스타민 분비 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 전복 내장 유래 가수분해물이 동물 피부내 IgE 유도 생체 내 항원항체반응 억제 효과를나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 정제된 펩타이드가 인간 비만 세포에서 사이토카인의 mRNA 발현 억제 효과에 대한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 정제된 펩타이드가 인간 비만 세포에서 사이토카인의 분비 억제 효과에 대한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 정제된 펩타이드가 인간 비만 세포에서 MAPKs 활성화 억제 효과에 대한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따라 정제된 펩타이드가 인간 비만 세포에서 IκBα 활성화 및 NF-κB의 핵내전사 억제 효과에 대한 결과이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0011] 본 발명은 전복(Haliotis discus hannai) 내장 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
[0012] 본 발명에 따르면 상기 방법으로 정제된 펩타이드가 항알러지 효과가 있어 인간 비만세포에서 유도되는 알러지반응을 억제할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알러지 반응 관련 질환에 유용하게 사용될수 있다.
[0013] 본 발명의 조성물은 의약 조성물로서 사용될 수 있다. 이 경우 상기 유효성분 외에 약학적으로 용인 가능한 담체, 첨가제, 식용 담체 또는 식품 첨가제를 선택적으로 포함하는 제형으로 제조할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제로는 희석제, 감미제, 안정제, 향료, 비타민류, 항산화제 등이 사용될 수 있다.
[0014] 상기 담체 또는 첨가제는 약학적으로 용인 가능한 것은 모두 가능하며, 예를 들어 희석제는 유당, 곡물 전분 등이 사용될 수 있으며, 감미제로는 설탕, 액상과당, 결정과당, 슈크랄로스, 솔비톨 또는 아스파탐이, 그리고 안정제로는 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 베타-사이클로덱스트린 또는 잔탄검 등이 사용될 수 있다. 또한, 조성물의 미각을 개선시키기 위해 과일향, 허브향 등 천연향료, 천연과즙, 플라보노이드 등 천연색소가 그리고 과당,꿀, 설탕등 감미성분 및 구연산, 구연산나트륨등 산미제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은상기 펩타이드 이외에 보조성분으로서 비타민 B, C, E 또는 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 무기질 성분 또는 레시틴 등 인지질 성분, 또는 올리고당, 아미노산, 타우린 등을 추가로 포함할 수 있다.
[0015] 한편, 본 발명의 약학 조성물은 정제(tablet), 캡슐(capsule), 드라제(dragee), 비드(bead), 과립(granule),용액(solution), 현탁액(suspension) 또는 사쉐(sachet) 중 어느 하나로 제형화 할 수 있다.
[0016] 본 발명은 하기의 구체적인 실시 예와 실험 예에 의해 보다 구체적으로 설명되나, 하기 실시 예와 실험 예는 본발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예1. UF 막 생물반응기를 [0017] 이용한 AIGID의 제조.
[0018] 전복 내장 소화가수분해물(AIGID)은 전복의 내장을 분리하여 생리식염수로 수차례 세척한 후 동결 건조하여 분말화하였다. 각각 전복 육 및 내장 분말 시료 20g에 증류수를 100mL 가하고 위 소화조건과 동일한 pH는 1.8 내지 2.2로 적정한 후, pepsin을 기질 대 효소비 250:1 비율로 첨가하고 35 내지 40℃로 shaker에서 1시간 30분내지 2시간 동안 위 소화(gastric digestion)조건 하에서 가수분해하였다. 그 후, 상기 가수분해물을을 담즙산염 혼합물(0.125 M 타우로콜레이트, 0.125 M 글리코데옥시콜릭산), 1 M CaCl, 0.25M 비스트 리스 (pH 6.5),0.1%(w/v) 및 돼지췌장 리파아제 (porcine pancreatic lipase)와 함께 섞은 후, pH 8.0 하에서 트립신과 알파-키모트립신을 이용하여 기질 대 효소비 250:1, 온도 35 내지 40℃, 반응시간 2 내지 3시간으로 소장(intestinal digestion) 조건 하에서 2차 가수분해시켰다.
[0019] 상기 2차 가수분해물을 10,000xg, 4℃에서 15분간 원심분리를 하였고 상청액을 5일 동안 동결건조하여 AIGID파우더를 얻어 UF 막 반응기 시스템에서 분획, 농축, 탈염하여 분자량별로 AIGID I(10kDa 이상), AIGID II(5-10kDa) 및 AIGID III(5kDa 이하) 등 3종의 분획물을 수득하였다(도1).
[0020] 실험예1. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물에 대한 세포 독성 확인.
[0021] 본 발명 상기 실시예1에서 얻은 전복 내장 유래 가수분해물로부터 제조한 3가지 분획물(AIGID I(10kDa 이상),AIGID II(5-10kDa) 및 AIGID III(5kDa 이하))에 대한 세포 독성은 MTT assay를 통해 확인하였다. 상기 MTTassay는 세포 독성 또는 생존율을 측정하는 실험법으로 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTTtetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하여microplate reader를 이용하여 검사하는 방법이다.
[0022] 이를 평가하기 위해 인간 비만 세포에 상기 실시 예1에서 얻은 전복 내장 유래 가수분해물로부터 제조한 3가지획물을 100 내지 500㎍/㎖의 농도를 각각 처리하였다. 대조군으로는 PMACI와 AIGDP 모두 처리하지 않은 군과PMACI만 처리한 군을 사용하여 비교하였다.
[0023] 실험 결과, 도 2에서 알 수 있듯이 100 내지 300㎍/mL 농도로 처리한 결과에서는 유의적인 차이가 없었으나,500㎍/mL 농도를 처리한 세포에서는 생존율이 약 35% 감소하였다. 이를 통해 본 발명 전복 내장 유래 분획물은100 내지 300㎍/mL의 농도에서 세포 독성 효과를 나타내지 않았다.
[0024] 실험예2. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질에 대한 히스타민 분비 억제 효과.
[0025] 본 발명에 따른 상기 실시예1에서 얻은 전복 내장 유래 가수분해물로부터 제조한 3가지 분획물(AIGID I(10kDa이상), AIGID II(5-10kDa) 및 AIGID III(5kDa 이하))이 세포에서 히스타민 분비 억제 효과는 히스타민 분비수치 검사를 통해 확인하였다. 히스타민은 아미노산 히스타민이 탈탄산된 것으로 비만세포 호염기구 세포 등에저장되어 있으며, 외부 자극에 의해 알러지 또는 아나필락시스 반응을 일으키는 물질이다.
[0026] 이를 평가하기 위해 인간 지방 세포에 PMACI를 유도해 세포에서 히스타민 분비 수치를 검사했다. 히스타민 분비수치 검사를 위해 인간 지방 세포에 전복 내장에서 유래한 AIGIDs를 상기 실험예1에서 정한 농도인 100 내지300㎍/mL의 농도를 처리하였고 1시간 후에 PMACI를 처리하였다. 대조군으로는 AIGID와 PMACI 모두 처리하지 않은 군과 PMACI만 처리한 군을 대조군으로 사용하여 비교 분석하였다.
[0027] 실험 결과, 도 3에서 알 수 있듯이 PMACI를 처리하였을 때 어느 것도 처리하지 않은 대조군에 비해 확실히 히스타민 분비가 증가하였고 AIGID I과 III를 처리한 군에서 PMACI만 처리한 군에 비해 유의적인 감소를 보였다. 이를 통해 본 발명 전복 내장에서 유래한 AIGID I과 III에서 300㎍/mL 농도로 처리하였을 때 항알러지 효과가 탁월하게 나타남을 알 수 있었다.
[0028] 실험예3. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질에 대한 동물 피부 내 IgE 유도 생체 내 항원항체반응 억제효과.
[0029] 본 발명에 따른 상기 실시예1에서 얻은 전복 내장 유래 가수분해물로부터 제조한 3가지 분획물(AIGID I(10kDa이상), AIGID II(5-10kDa) 및 AIGID III(5kDa 이하))에 대한 동물 피부 내 IgE 유도 생체 내 항원항체반응 억제 효과는 PCA(passive cutaneous anaphylaxis) reaction을 통해 확인하였다. PCA 반응은 생체 내 항원항체반응을 알아보는 검사법으로 in vivo로 미량의 항체와 항원과의 반응을 보는 방법으로서, 미량항체를 동물의 피부내에 주사한 뒤, 대응 항원과 색소를 정맥 주사하여 국소에 색소가 몇 분 뒤에 모이는 것을 관찰하는 방법이다.
이를 평가하기 위해서 PCA mouse 모델에 AIGIDs 50mg/kg을 DNP-HSA 100ug과 [0030] 함께 복강 내 투여하였고 1시간 후 DNP-HSA 항원에 대하여 Anti-DNP-IgE 500ng을 피부 내에 투여하였고 spectrometer를 이용해 생체 내 항원항체반응 정도를 측정하였다. 대조군으로는 어느 것도 처리하지 않은 군과 DNP-IgE와 DNP-HSA만 처리한 군을 사용하여 비교분석하였다.
[0031] 실험 결과, 도 4에서 알 수 있듯이 AIGID III를 투여하였을 때 DNP-IgE와 DNP-HSA만 투여한 대조군과 비교하여확실하게 억제되었다. 이를 통해 본 발명 전복 내장에서 유래한 AIGID III가 AIGID I 또는 AIGID II 보다 알러지 치료 효과가 뛰어나다는 것을 확인하였고, 이를 통해 in vitro 실험에 AIGID III를 사용하였다.
[0032] 실시예2. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질로부터 정제된 펩타이드의 분자량과 아미노산 서열 분석.

[0033] 본 발명에 따른 실시예1에서 얻은 전복 내장 유래 가수분해물로부터 제조한 3가지 분획물(AIGID I(10kDa 이상),AIGID II(5-10kDa) 및 AIGID III(5kDa 이하)) 중 AIGID III 분획물로부터 펩타이드를 정제한 후 Q-TOF 질량분석기를 통하여 분자량과 아미노산 서열 분석하여 동정하였다.
[0034] 이를 위해 AIGID III를 chromatographic 방법을 통해 정제하였다. FPLC와 RP-HPLC의 반복을 통해 AIGDP의 정확한 분자량과 아미노산 서열을 분석했다.
[0035] AIGDP로부터 분리한 펩타이드(AIGDP)의 분자량은 1,175.2Da인 것을 확인하였고, 전체 아미노산 서열은PFNQGTFAS(Pro-Phe-Asn-Gln-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser)으로 확인하였다(도1).
[0036] 실험예4. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질로부터 정제된 펩타이드(AIGDP)의 인간 비만 세포에서 PMACI에의해 유도된 사이토카인의 mRNA 발현 억제.
[0037] 본 발명에 따른 상기 실시예2에서 얻은 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해유도된 사이토카인(IL-1, IL-6, TNF-α)의 mRNA의 발현 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 통해 확인하였다.
사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 작용하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 하며 외부의 침입에 대해서 인체의 방어체계를 제어하고 자극하는 역할을 한다. 이와 같이 사이토카인은 알러지에 의한 염증 유발을 감소시키는 중요한 지표이다. 그리고 RTPCR은역 전사 반응을 통해 primer를 이용하여 타겟 유전자를 증폭하는 방법이다.
[0038] 이를 평가하기 위해서 그 후 인간 지방 세포에 1시간 동안 AIGDP를 100 내지 300㎍/㎖ 농도로 전처리하였고, 6시간 동안 PMACI를 이용해 자극을 주었다. 그 후 세포에서 TRIzon reagent를 이용해 RNA를 분리하였다. M-MLV전사 효소를 이용해 세포의 total RNA(1.0ug)에서 cDNA를 만들었고, 특정 primer를 이용해 cDNA를 증폭했다.
증폭한 cDNA를 전기영동을 통해 아가로즈 젤에서 PCR 반응에 의해 생성된 단백질을 확인하였다. 대조군으로는PMACI와 AIGDP 모두 처리하지 않은 군과 PMACI만 처리한 군을 사용하여 비교하였다.
[0039] 실험 결과, 도 5에서 알 수 있듯이 정제된 펩타이드에 의한 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해 유도되는 사이토카인 IL-1, IL-6, TNF-의 발현량을 PMACI만 처리한 대조군과 비교하였을 때 AIGDP를 처리한 군에서 사이토카인의 발현량이 억제되었다. 특히, AIGDP 300㎍/mL 농도에서 사이토카인의 발현량이 크게 억제되었다.
[0040] 실험예5. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질로부터 정제된 펩타이드(AIGDP)의 인간 비만 세포에서 PMACI에의해 유도된 사이토카인의 분비 억제.
[0041] 본 발명에 따른 상기 실시예2에서 얻은 펩타이드를 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해 유도된 사이토카인(IL-1,IL-6, TNF-)의 분비 억제 효과를 확인하기 위해 cytokine assay를 통해 확인하였다. cytokine assay는 항원항체 결합을 이용한 일반적인 ELISA를 이용한 방법이다. 사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 작용하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 하며 외부의 침입에 대해서 인체의 방어체계를 제어하고 자극하는 역할을 한다. 이와 같이 사이토카인은 알러지에 의한염증 유발을 감소시키는 중요한 지표이다.
이를 평가하기 위해서 인간 지방 세포에 100 내지 300㎍/㎖ 농도의 AIGDP를 [0042] 1시간 동안 전처리하였고 그 후에PMACI를 8시간 동안 자극을 주었다. 사이토카인의 발현 양은 ELISA kit를 이용하여 ELISA plate reader를 통해450nm의 파장에서 확인하였다. 대조군으로는 PMACI와 AIGDP 모두 처리하지 않은 군과 PMACI만 처리한 군을 사용하여 비교하였다.
[0043] 실험 결과, 도 6에서 알 수 있듯이 정제된 펩타이드에 의한 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해 유도되는 사이토카인 IL-1, IL-6, TNF-의 발현량을 PMACI만 처리한 대조군과 비교하였을 때 AIGDP를 처리한 군에서 사이토카인의 발현량이 억제되었다. 특히 AIGDP 300㎍/mL 농도에서 사이토카인의 발현량이 크게 억제되었다.
[0044] 실험예6. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질로부터 정제된 펩타이드(AIGDP)의 인간 비만 세포에서 PMACI에의해 유도된 MAPKs 활성화 억제.
[0045] 본 발명에 따른 상기 실시예2에서 얻은 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해유도된 MAPKs(p38, ERK, JNK) 활성화 억제 효과를 확인하기 위해 western blot 방법을 이용하였다. MAPK는Mitogen-activated protein kinase로서 각종 세포증식인자 또는 발암촉진제 등의 자극에 의해 활성화되는 세린-트레오닌인산화효소로서 발견된 효소로 세포증식이나 분화를 제어하는 세포내 신호전달경로 상에서 존재하여 하류에서 세포의 증식이나 분화의 조절 등에 작용한다. 특히 p38과 JNK는 여러 가지 스트레스 자극, 염증성 사이토카인에 의해 활성화하여 세포자살, 스트레스 응답, 분화 등에 관여하고 ERK는 세포 증식에 관여한다. 이와 같이 MAPKs는 세포의 활성화, 생존, 분화 및 사이토카인 생성 등 면역반응에서 중요한 역할을 한다. 그러므로MAPK pathway는 알러지의 약리학적 치료에 중요하다고 볼 수 있다. 그리고 Western blot은 여러 단백질의 혼합물로부터 특정 단백질을 찾아내는 기법으로 전기영동을 통해 분리한 단백질을 membrane으로 이동시켜 항체를 이용해 특정 단백질을 검출하는 기법이다.
[0046] 이를 평가하기 위해서 인간 지방 세포에 AIGDP를 1시간 동안 전처리를 하고 PMA와 함께 MAPKs의 활성화를 위해1uM의 A23187를 30분 동안 반응시켰다. 그 후 세로를 PBS로 3차례 washing 하고 10% SDS gel에 동량의 단백질을 분주하여 전기영동을 하였다. 그 후 nitrocellulose membrane에 transfer 한 후 primary ab와 secondary ab를 각각 1시간씩 실온에서 반응시켰다. 3차례 TBST로 washing 후 단백질을 확인하였다. PMACI에 의해 유도되는MAPKs의 활성화 정도를 확인하기 위해 인사화된 단백질과 인사화되지 않은 단백질을 모두 확인하여 비교하였고,대조군으로는 PMACI와 AIGDP 모두 처리하지 않은 군과 PMACI만 처리한 군을 사용하여 비교하였다.
[0047] 실험 결과, 도 7에서 알 수 있듯이 정제된 펩타이드에 의한 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해 유도되는 MAPKs의활성화는 JNK, P38과 ERK 1/2 3가지 형태 모두 증가했지만, ERK 1/2와 p38과는 달리 JNK에서는 PMACI에 의한인산화가 유도됐다. 이를 통해 전복 내장 유래 펩타이드에 의한 MAPKs의 활성화 억제를 통해 항알러지 효능이탁월하게 나타남을 확인할 수 있었다.
[0048] 실험예7. 본 발명 전복 내장 유래 가수분해물질에서 정제된 Iκ-Bα 활성화 및 NF-B의 핵내전사 억제.
[0049] 본 발명에 따른 상기 실시예2에서 얻은 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 인간 비만 세포에서 PMACI에 의해유도된 Iκ-Bα 활성화 및 NF-κB의 핵내전사 억제 효과를 확인하기 위해 western blot와 electrophoreticmobility shift assay(EMSA)를 이용하였다. EMSA는 단백질과 DNA의 상호작용 여부를 확인하는 실험으로 전사인자의 특징에 대해 분석할 때 실시하는 실험법이다. 핵 추출물에 있는 전사인자가 DNA와 결합하면서 미리 표지해둔 형광에 읽어내는 방법으로 결합력이 강력한 DNA의 경우 결합력이 강해지며 항체를 첨가해 단백질의 DNA 결합부위와 결합해 shift가 일어나는지 확인하는 실험기법이다. 여기서 많은 전사 요소는 알러지의 병리 생리학과관련이 있고, NF-κB는 알러지와 같은 다양한 자극에 의해서 활성화된다. NF-κB 이합체는 대부분 세포에서 Iκ-Bα와 같은 억제제와 결합하여 비활성화 상태로 세포질 내에서 보통 존재한다. 외부 자극에 의해서 Iκ-Bα의특이적 인산화에 의해 NF-κB로부터 해리되고 핵으로 이동해 염증 유전자, 사이토카인, 효소, 세포부착분자와급성기단백질의 광범위한 발현을 유도한다. 그리고 Iκ-Bα 인산화와 이것의 degradation 억제에 의해 PMACI에의해 유도되는 NF-κB 활성화를 AIGDP가 억제한다. 이와 같이 NF-κB 활성화 측정은 사이토카인을 억제시켜 알러지에 염증 유발을 감소시키는 효과를 확인할 수 있는 기법이다.
[0050] 이를 평가하기 위해 인간 비만 세포에 AIGDP(100 내지 300㎍/mL)를 전처리하였고, 30분 후에 PMACI를 2시간 동안 자극하였다. western blot을 통해 Iκ-Bα와 p-Iκ-Bα의 level을 측정하였고 EMSA를 통해 NF-κB의level을 측정하였다. 대조군으로는 PMACI와 AIGDP 모두 처리하지 않은 군과 PMACI만 처리한 군을 사용하여 비교하였다. 모든 실험은 3번 반복하였다.실험 결과, 도 8-(a)에서 알 수 있듯이 정제된 펩타이드에 의한 인간 비만 세포에서

[0051] PMACI 자극에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화는 핵에서 AIGDP에 의해 감소하는 것을 확인하였고, 세포기질에서 Iκ-Bα는 증가하는 반면,Iκ-Bα의 인산화가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 도 8-(b)에서 알 수 있듯이 PMACI 자극에 의해 NF-κB가증가했으나 AIGDP 처리에 의해 NF-κB가 억제되는 것을 확인하였다. 이를 통해 Iκ-Bα 인산화를 억제시켜 NF-κB 활성화를 억제해 사이토카인 억제를 통해 알러지 효과를 억제하는 것을 확인하였고 그 효과 또한 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
산업상 이용가능성
[0052] 이상 설명한 바와 같이 본 발명은 전복 내장으로부터 정제된 펩타이드는 인간 비만 세포에서 알러지 반응을 억제하는 효과를 나타낼 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알러지 반응 관련 질환에 유용하게사용될 수 있으므로 생물 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.