MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속 질병 진단 시스템

본 발명은 MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속 질병 진단 시스템에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅 분석은 질병 진단의 획기적인 시간 단축 및 대량 분석을 가능하게 하며, 혈액 분석을 통한 진단방법으로 비용 및 시간적 부담이 적고 환자의 진단에 대한 거부감을 해소하여 질병 진단의 접근성이 용이하다. 또한, 혈액 내 대사체 추출 및 데이터베이스 구축을 통한 진단 결과와 혈액 내 단백질 기반 데이터베이스를 이용한 진단 결과를 비교 분석하여 이중 검사(double checking)로 높은 정확도 및 신뢰성을 갖는 진단이 가능하다. 또한, 본 발명은 데이터베이스 기반의 진단법으로 다양한 질병에 적용될 수 있어 기술의 확장성이 좋으며, 혈액 분석의 질량분석 바코드 데이터베이스 구축을 통해 사람의 건강 상태를 바코드화하여 확보할 수 있기 때문에 사회적으로 효과적인 국민 건강관리에 기여할 수 있다. 또한, 종래의 숙련된 전문가를 요하는 진단방법이 아닌 간단한 교육을 통해 수행 가능한 진단법으로써 기술의 진입 장벽이 낮아 기술의 파급력이 강한 장점이 있다.

청구범위
청구항 1
환자군 및 대조군으로부터 분리된 혈청 시료로 각각 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry) 질량분석을 수행하여 혈청 단백질 스펙트럼 데이터를 획득하는 데이터 획득수단;상기 스펙트럼 데이터를 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrum profile; MSP) 라이브러리로 변환하는 MSP 라이브러리 변환 수단;환자로 의심되는 객체로부터 분리된 혈청 시료의 MSP 라이브러리를 상기 환자군 또는 대조군의 MSP 라이브러리와 각각 비교하여 매칭 점수로 변환하는 실시간 매칭 점수 변환 수단; 및상기 매칭 점수를 이용하여 환자로 의심되는 객체의 질병 여부를 진단하는 진단 수단;을 포함하는 질병 진단 시스템.
청구항 2
제 1항에 있어서, 상기 혈청 시료는 증류수를 이용하여 혈청을 2 내지 8 부피%로 희석시킨 것을 특징으로 하는질병 진단 시스템.
청구항 3

제 1항에 있어서, 상기 혈청 단백질 스펙트럼 데이터는 환자군 및 대조군의 혈청 시료를 각각 MALDI 플레이트에로딩 및 건조시키고, MALDI 매트릭스 용액을 로딩한 후, MALDI-TOF 질량분석을 수행하여 획득되는 것을 특징으로 하는 질병 진단 시스템.
청구항 4
제 3항에 있어서, 상기 MALDI 매트릭스 용액은 아세토니트릴(acetonitrile), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA) 및 α-시아노-4-하이드록시시나믹산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; HCCA)을포함하는 것을 특징으로 하는 질병 진단 시스템.
청구항 5
제 1항에 있어서, 상기 매칭 점수는 0 내지 3의 범위로 표시되고,상기 진단 수단은, 환자로 의심되는 객체를 환자군 또는 대조군 각각의 매칭 점수 중 3에 가까운 매칭 점수를가지는 군과 상동성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 질병 진단 시스템.
청구항 6
제 1항에 있어서, 상기 환자는 암 환자인 것을 특징으로 하는 질병 진단 시스템.
청구항 7
제 6항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암,자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종,질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종,척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 질병 진단시스템.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass [0001] spectrometry) 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속 질병 진단 시스템에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 인간 혈청은 암 바이오마커 발견 및 진단을 위하여 임상적으로 사용되는 가장 중요한 체액 중 하나이다. 시료는혈청 특이 단백질뿐만 아니라 인체의 암 조직 및 세포로부터 합성되거나 분비되는 단백질들을 포함할 수 있다.
따라서, 혈청 단백질 프로파일(profile)은 개인의 건강과 질병 상태를 반영할 수 있으며, 혈청 시료를 채취하는것이 상대적으로 쉽기 때문에 혈청에 존재하는 암 바이오마커 단백질은 진단검증 및 치료를 위한 가장 일반적인타겟으로 사용될 수 있다. 예를 들어, α-태아단백(α-fetoprotein; AFP), 암 배아 항원(carcinoembryonicantigen; CEA), 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen; PSA), 면역글로불린 및 융모성 생식선 자극호르몬(chorionic gonadotropin; hCG)과 같이 혈청에 존재하는 여러 가지 암 바이오마커들은 일반적으로 임상 모니터링 매개변수로 사용되어 왔다. 그러나 특이적인 암 바이오마커 기반 스크리닝은 바이오마커 단백질의 수준을높일 수 있는 다른 면역학적 사건들로 인해 위양성(false positives) 및 낮은 특이성을 가지는 단점이 있다. 따라서, 혈청을 기반으로 하는 암 진단을 위한 혁신적이고 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이다.
[0003] 대부분의 암 진단기술은 면역분석법 또는 질량분석법에 의존해 왔다. 종래 효소면역측정법(enzyme-linkedimmunosorbent assay; ELISA)의 경우, 혈청 단백질의 혼합물로부터 암 바이오마커를 확인하고 정량하기 위해 특정 항체를 사용하며, 이는 정확하고 특이적이며 민감한 장점이 있다(pg mL-1수준의 검출 한계). 또한, ELISA는많은 수의 시료를 병렬로 신속하게 검사할 수 있기 때문에, 많은 병원 및 진단 기관에서 바이오마커의 표적 평가에 사용되고 있다. 그러나, ELISA는 다중 바이오마커의 정량 측정, 분석법 개발에 대한 높은 초기 비용 등과은 몇 가지 단점이 존재한다. 특히, ELISA 기반 암 스크리닝에 사용 가능한 혈청 단백질 바이오마커 및 이들의 특이적 항체의 수는 여전히 제한적이다.
[0004] 한편, 질량분석법은 새로운 혈청 단백질 바이오마커 스크리닝 및 다중 바이오마커 식별을 동시에 수행하는 암진단방법으로 사용되고 있다. 상기 목적을 위해, 액체 크로마토그래피 탠덤-질량분석법(liquid chromatographytandem-mass spectrometry; LC-MS/MS)은 비표적화 및 표적화된 혈청 단백질 바이오마커 스크리닝에 모두 적용될수 있다. 최근 다중 바이오마커 식별 및 모니터링이 고해상도 LC-MS/MS를 사용하는 표적 프로테오믹스(다중 반응 모니터링(multi reaction monitoring; MRM) 또는 병렬 반응 모니터링(parallel reaction monitoring; PRM))에 의해 달성된 바 있다. LC-MS/MS는 높은 선택성, 높은 민감도 및 확실한 표적 펩타이드 확인을 통한 정량재현성을 제공하지만, 많은 수의 환자 혈청 시료를 처리하기 위한 견고하고 높은 처리량 분석에는 적합하지 않다.
[0005] 따라서, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 기반혈청 단백질의 전체 프로파일링을 통해 간단하면서도 강력한 암 진단방법을 개발하고자 한다. MALDI-TOF MS는빠른 처리 시간과 고속 처리 분석 플랫폼을 제공할 수 있다. 본 발명에서는 MALDI-MS 기반의 혈청 단백질 핑거린팅 방법을 사용하여 혈청 시료나 MALDI 플레이트(plate)를 전처리하지 않고 암을 진단하는 신기술을 제공하고자 한다.
선행기술문헌
특허문헌
[0006] (특허문헌 0001) 대한민국 등록특허 제 10-1214317호(2012.12.13 등록)
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 목적은 MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 [0007] 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속질병 진단 시스템을 제공하는 데에 있다.
과제의 해결 수단
[0008] 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환자군 및 대조군으로부터 분리된 혈청 시료로 각각 MALDITOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 질량분석을 수행하여혈청 단백질 스펙트럼 데이터를 획득하는 데이터 획득 수단; 상기 스펙트럼 데이터를 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrum profile; MSP) 라이브러리로 변환하는 MSP 라이브러리 변환 수단; 환자로 의심되는 객체로부터분리된 혈청 시료의 MSP 라이브러리를 상기 환자군 또는 대조군의 MSP 라이브러리와 각각 비교하여 매칭 점수로변환하는 실시간 매칭 점수 변환 수단; 및 상기 매칭 점수를 이용하여 환자로 의심되는 객체의 질병 여부를 진하는 진단 수단;을 포함하는 질병 진단 시스템을 제공한다.
발명의 효과
[0009] 본 발명에 따르면, MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅 분석은 질병 진단의 획기적인 시간 단축 및 대량 분석을 가능하게 하며, 혈액 분석을 통한 진단방법으로 비용 및 시간적 부담이적고 환자의 진단에 대한 거부감을 해소하여 질병 진단의 접근성이 용이하다. 또한, 혈액 내 대사체 추출 및 데이터베이스 구축을 통한 진단 결과와 혈액 내 단백질 기반 데이터베이스를 이용한 진단 결과를 비교 분석하여이중 검사(double checking)로 높은 정확도 및 신뢰성을 갖는 진단이 가능하다. 또한, 본 발명은 데이터베이스기반의 진단법으로 다양한 질병에 적용될 수 있어 기술의 확장성이 좋으며, 혈액 분석의 질량분석 바코드 데이터베이스 구축을 통해 사람의 건강 상태를 바코드화하여 확보할 수 있기 때문에 사회적으로 효과적인 국민 건강관리에 기여할 수 있다. 또한, 종래의 숙련된 전문가를 요하는 진단방법이 아닌 간단한 교육을 통해 수행 가능한 진단법으로써 기술의 진입 장벽이 낮아 기술의 파급력이 강한 장점이 있다.
도면의 간단한 설명
[0010] 도 1은 종래 질병의 진단방법을 도식하여 나타낸 것이다.
도 2는 MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 하는 혈액 단백질 및 대사체 핑거프린팅을 이용한 초고속 질병 진단시스템을 도시하여 나타낸 것이다.
도 3은 실험군(간암 환자) 및 대조군(정상인)의 혈청으로 MALDI-TOF 질량분석법을 수행하여 단백질 프로파일을수집한 후, 이를 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrum profile; MSP)로 변환하여 수평 베이스라인 및 각 군의상대적인 강도로 나타낸 것이다.
도 4는 혈청 시료를 실험군 MSP 및 대조군 MSP에 적용하여 자동화된 매칭 시스템에 의한 질병의 진단 가능 여부를 확인한 것이다.
도 5는 혈청 시료를 실험군 MSP 및 대조군 MSP에 적용하여 부분 최소 자승 판별 분석에 의한 질병의 진단 가능부를 확인한 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0011] 현재 대표적인 질병의 진단방법으로는 혈액 검사, 초음파 검사, 조직 검사 등 여러 진단방법이 있으나, 종래 질병의 진단방법은 도 1과 같이, 혈액 검사, 영상 검사, 조직 검사로 크게 3가지로 나누어졌다. 첫 번째로 혈액검사방법 중 간 검사를 위한 혈액 검사로 정상인과 환자의 혈액 내 α-태아단백(α-fetoprotein; AFP)의 상대적인 정량 차이를 이용한 진단방법이 널리 사용되었다. 그러나 상기 혈액 검사는 정확성이 떨어지고, 질병뿐만 아라 임신, 염증 등 기타의 경우, 오진의 확률이 있어 정확성이 떨어지는 문제점이 있다. 두 번째로 영상 검사방법에는 간 초음파 검사, 전산화 단층촬영 검사(computerized tomography; CT), 자기공명영상(magneticesonance imaging; MRI) 검사 및 간 혈관 조영술이 있는데, 이중 간 초음파 검사는 간편하고, 경제적이며, 정확성이 높아 널리 사용되었고, CT나 MRI 등의 영상 검사방법은 진단 비용이 비싸고, 진단 시간이 오래 걸리며,진단 과정이 복잡하여 숙련된 전문가 등 고급 인력의 수급을 필요로 하는 단점이 있었다. 마지막으로 상기 두방법으로 결과를 얻지 못하는 경우, 초음파나 전산화 단층촬영 검사 하에, 가는 바늘을 찔러　넣어 조직을 채취하는 침생검을 수행하여 조직학적인 분석을 통해 진단하는 방법이 있었다. 그러나, 상기 기술한 바와 같이, 종래 질병의 진단방법은 절차가 복잡하고 다량의 시료를 단시간에 분석하는데 적합하지 않아 새로운 질병 진단 시스템의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 도 2와 같이, MALDI-TOF 질량분석법을 기반으로 [0013] 하는 혈액 단백질 및 핑거프린팅을이용한 초고속 질병 진단 시스템을 제공하고자 한다.
[0014] 본 발명의 발명자들은 실험군(간암 환자) 및 대조군(정상인)의 혈청을 증류수로 희석한 후, 추가 정제 또는 분리 공정 없이, Flexcontrol을 통해 MALDI-MS 단백질 프로파일을 수집하였으며, MALDI Biotyper를 사용하여 이를 각각 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrum profile; MSP)로 변환하였다. 상기 실험군 및 대조군의 MSP를플랫폼으로 적용하면, 소량의 혈액 시료로부터 높은 정확도 및 신뢰도를 갖는 질병의 진단이 가능하고, 자동화된 매칭 시스템을 통해 고속 처리로 질병을 진단 및 분류할 수 있다.
[0016] 이에, 본 발명은 환자군 및 대조군으로부터 분리된 혈청 시료로 각각 MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 질량분석을 수행하여 혈청 단백질 스펙트럼 데이터를 획득하는 데이터 획득 수단; 상기 스펙트럼 데이터를 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrum profile; MSP)이브러리로 변환하는 MSP 라이브러리 변환 수단; 환자로 의심되는 객체로부터 분리된 혈청 시료의 MSP 라이브러리를 상기 환자군 또는 대조군의 MSP 라이브러리와 각각 비교하여 매칭 점수로 변환하는 실시간 매칭 점수 변환 수단; 및 상기 매칭 점수를 이용하여 환자로 의심되는 객체의 질병 여부를 진단하는 진단 수단;을 포함하는질병 진단 시스템을 제공한다.
[0017] 상기 혈청 시료는 증류수를 이용하여 혈청을 2 내지 8 부피%로 희석시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은아님을 명시한다.
[0018] 상기 혈청 단백질 스펙트럼 데이터는 환자군 및 대조군의 혈청 시료를 각각 MALDI 플레이트에 로딩 및 건조시키고, MALDI 매트릭스 용액을 로딩한 후, MALDI-TOF 질량분석을 수행하여 획득될 수 있다.
[0019] 상기 MALDI 매트릭스 용액은 아세토니트릴(acetonitrile), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)및 α-시아노-4-하이드록시시나믹산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; HCCA)을 포함할 수 있다.
[0020] 도 3과 같이, MALDI flexcontrol 소프트웨어로부터 얻어진 질량 스펙트럼을 변환하는, 상기 MSP 라이브러리 변환 수단은 Biotyper 3 소프트웨어일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
[0021] 또한, 상기 Biotyper 3 소프트웨어를 통해 변환된 실험군 및 대조군의 주요 스펙트럼 프로파일(main spectrumprofile; MSP)과 임상 샘플의 상동성을 확인할 수 있는, 상기 실시간 매칭 점수 변환 수단은 Biotyper RTC 소프트웨어일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
[0022] 상기 매칭 점수는 0 내지 3의 범위로 표시되고, 상기 진단 수단은, 환자로 의심되는 객체를 환자군 또는 대조군각각의 매칭 점수 중 3에 가까운 매칭 점수를 가지는 군과 상동성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
[0023] 상기 환자는 암 환자일 수 있으며, 상기 암은 간암, 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
[0025] 이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다
는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[0027] 실시예 1: 화학 물질 및 시약
[0028] 아세토니트릴(acetonitrile)은 Junsei Chemical Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하였으며, 증류수 및 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. α-시아노-4-하이드록시시나믹산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; HCCA), 펩타이드 표준물질(standard) 및 박테리아 시험은Bruker(Bremen, Germany)에서 구입하였다.
실시예 2: 실험군(간암 환자) [0030] 및 대조군(정상인)의 혈청 수집
[0031] 추출한 혈액은 응고제와의 반응을 위해 최소 20분 동안 튜브에서 방치하였다. 모든 혈청 시료는 연구윤리심의위원회(institutional review board; IRB)의 승인을 받은 후 경북대학교병원의 표준화된 프로토콜에 따라 수집하였다. 10 cc 튜브(serum separator vacutainer tube, BD Vacutainer SST II Advance REF 367953)에 혈액을 넣고, 2,500 rpm으로 5분간 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청 시료는 냉동바이알(cryovial)에 300 μl씩 분주하여, 실험 전까지 -80℃ 또는 액체 질소 탱크에서 보관하였다.
[0032] 54명의 간암 환자로부터 혈청 시료를 얻었으며, 간암 환자의 평균 연령은 57.2세(32.6 ~ 90.3세)였고, 실험군(간암 환자)은 병리학적으로 입증된 모든 단계의 공통 아형의 간암을 포함하였다. 대조군(정상인)은 암 질환이없는 99명의 정상인으로 평균 연령은 50.0세(25.9 ~ 76.7세)였다.
[0034] 실시예 3: MALDI-TOF 질량분석 및 MALDI Biotyper
[0035] 실험군(n=40)과 대조군(n=80)의 혈청은 증류수를 이용하여 4%(v/v)로 희석 하였다. 1 μl의 희석된 혈청을 MSP96 target polished steel MALDI 플레이트에 즉시 로딩하고 상온에서 건조시켰다. 이후 47.5 부피% 증류수-50부피% 아세토니트릴-2.5 부피% 트리플루오로아세트산 250 μl에 α-시아노-4-하이드록시시나믹산 매트릭스 2 mg를 용해시킨 용액 1 μl를 적정하였다.
[0036] 건조 후, 펩타이드 표준물질 및 박테리아 시험 표준물질(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)의 혼합물을 이용하여 다음 조건과 같이, Bruker Daltonics Microflex LRF MALDI-TOF MS(Bruker, Bremen, Germany)를 교정(calibration)하였다: 양이온 및 선형 모드, 검출기 값=7.0, 레이저 주파수=60.0 Hz, 레이저 출력=44%. 저 질량 범위(m/z 1,000 ~ 2,000)를 커버하기 위해 표준물질의 혼합물을 적용하였다. 이어서, 실험군 및 대조군의 각스펙트럼은 다음 조건과 같이, AutoeXecute를 이용하여 240 샷(shots) 당 스팟(spot)을 수집하여 획득하였다:
질량 범위(m/z 1,000 ~ 20,000), 피크 해상도 > 400 ppm, 레이저 출력=52 ~ 56%. 각 혈청에서의 상이한 피크를포함하여 동일하게 검출된 피크에 대해서도, 획득한 스펙트럼을 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 임계값(threshold)에 의해 MSP에 적합한지를 시각적으로 평가하였다. 즉, Flexanalysis 3.3 소프트웨어(Bruker,Bremen, Germany)를 사용하여 두 개의 가장 상이한 스펙트럼의 오차가 500 ppm 미만인 피크를 포함하는 스펙트럼의 경우 MSP에 사용되었고, 500 ppm을 초과하는 경우 시료를 재분석하였다.
[0037] 그 다음, 도 3과 같이 Biotyper 3 소프트웨어(Bruker, Bremen, Germany)를 사용하여 실험군 및 대조군의 혈청으로부터 획득한 스펙트럼을 각 선 스펙트럼 (line spectrum) 형태로 변환하여 MSP로 단일화하였다. 즉, 각각의MSP는 각 실험군 및 대조군의 모든 혈청의 침전물을 포함한다. 또한, 상기 소프트웨어 및 매칭 점수(matchingscore)를 사용하여 실험군 및 대조군 간 MSP 이질성을 확인하였다.
[0038] 마지막으로 통합 MSP는 Biotyper RTC 소프트웨어(Bruker, Bremen, Germany)를 사용하여 실험군(n=13) 및 대조군(n=18)의 맹검 검사 세트와 통합 MSP 간의 매칭을 통해 검증되었다. 상기 기술한 바와 같이, 검사 세트 시료는 Biotyper RTC 소프트웨어를 사용하여 Biotyper 3 소프트웨어의 방법으로 변환된 통합 MSP와 자동으로 매칭되었다. 이때, 선 스펙트럼 형태의 통합 MSP와 맹검 검사 세트의 스펙트럼 피크(peaks)와 강도(intensity)의 일치도가 0에서 3 범위의 매칭 점수로 표시되며, 매칭 점수가 3에 가까울수록 통합 MSP와 새로운 스펙트럼 사이의상동성 확률이 높음을 의미한다(도 4 참조).
[0040] 실시예 4: 다변량 분석(multivariate analysis)
[0041] 획득한 데이터 세트는 다변량 통계 분석을 위해 SIMCA-P + 12.0 소프트웨어(Umetrics, Sweden)로 처리되었다.
데이터는 베이스라인(baseline) 편차와 노이즈의 영향을 줄이기 위해 파레토-스케일(pareto-scale)로 조정되었다. 이상치(outliers)를 확인하기 위해, 주성 성분 분석(principal component analysis; PCA)을 수행하였으며,대조군 및 실험군 시료 세트를 구별하기 위해, 부분 최소 자승 분석(PLS-DA)을 수행하였다. 군 분리와 관련된유의한 피크는 투영(projection) (VIP > 2)에서의 변수 중요도 및 군 간에 2 이상 또는 0.5 미만의 배수 변화값(fold change values)으로 설명되었다.
실험예 1: 간암 진단을 위한 MALDI

[0043] 질량분석 패턴 인식 시스템
[0044] 암 진단 플랫폼을 검증하기 위해, 분석 검증, 임상 검증 및 임상 적용의 3 단계 과정을 수행하였다. 먼저, 시료준비 과정이 적절한지 여부를 확인하기 위해 분석 검증을 수행하였다. 또한, 실험군 및 대조군 간에 질량 스펙트럼 패턴이 상이한지를 시험하였다. 수집한 혈청은 증류수로 희석하고, 이어서 MALDI-MS 프로파일링에 사용하였다. 시간 소모적인 추가 정제 단계 없이, 각 혈청 시료에 대해 10초 이내에 절차가 완료되었다.
SELDI(surface-enhanced laser desorption/ionization)를 이용한 혈청 단백질 프로파일에 기초한 이전의 연구와 비교하여 보면 현저한 시간 단축을 보였다. 특히, SELDI는 플레이트 준비로서 항체를 고정시키는 과정이 필요한 단점이 있다. 시료 준비 후, 실험군 및 대조군의 혈청에 대한 질량 스펙트럼 수집은 자동으로 수행되었다.
결과적으로, 스펙트럼 질을 40 샷(shot) 당 2,000 이상의 수평 베이스라인 및 강도로 확인함으로써 시료 준비과정이 적합함을 확인하였다. 또한, 실험군 및 대조군이 상이한 질량 패턴을 가지는 것을 확인하였다.
[0045] 다음 단계인 임상 검증에서 대조군(n=80) 및 실험군(n=40)을 각각 검출하기 위해, 혈청 단백질 프로파일을 통합MSP로 변환하였다. 그 다음, 통합 MSP의 이질성은 Biotyper 3 소프트웨어를 사용하여 비교 점수로 확인하였고,Biotyper RTC에 의한 간암 분류 가능성을 확인하였다. 마지막 단계에서 Biotyper RTC를 사용하여 간암에 대한혈청 기반 분류 플랫폼이 확실한 결과를 제공하는지를 확인하기 위해 임상적 적용으로 맹검 검사를 수행하였다.
[0047] 실험예 2: 분석 및 임상 검증
[0048] 암 스크리닝 플랫폼에 요구되는 중요한 요건 중 하나는 고속 처리이며, 공정 과정 및 시료의 종류(혈청 또는 조직 등) 또한 플랫폼의 가용성에 상당 부분을 차지한다. 시료의 단백질 프로파일에 의한 암 진단에 다양한 질량분석법이 활용되고 있으나 몇 가지 단점이 존재했다. 최근 연구(Geoffrey Barioude et al.)에 따르면, 칩에 어떠한 표면 처리 과정 없이, 조직 기반의 MALDI-TOF 질량분석 결과, 폐암 진단에 대한 만족스러운 결과를 나타낸것으로 보고된 바 있다. 그러나, 상기 방법은 준비 과정이 간단하나 분석 표본으로서의 조직이 고속 처리 스크리닝에 적합하지 않다는 단점이 있다.
[0049] 따라서, 본 발명에서는 고속 처리를 위해 시료로 혈청을 사용하였으며, 물로 희석하여 준비하였다. 이후 준비된시료[간암 환자(n=40), 대조군(n=80)]는 MALDI-TOF 질량분석법으로 분석되었고, 혈청 단백질의 전체 프로파일은AutoeXecute에 의해 자동으로 수집되었다: 해상도 > 300 ppm, 범위: 1,000 ~ 8,000. 획득된 스펙트럼의 질은40 샷(shot) 당 3,000 이상의 수평 베이스라인 및 강도로 확인하였으며, 스펙트럼은 도 3에 나타내었다. 결과적으로 MSP로 변환되기 전, 실험군 및 대조군의 스펙트럼은 상이한 질량 프로파일을 갖는 것을 확인하였다. 특히,실험군 및 대조군 혈청에서 얻은 질량 스펙트럼의 피크는 낮은 질량 범위(< 10 kDa)에서 서로 상이하였다.
또한, 실험군 혈청에서 각 질량 피크에 대한 상대 강도는 대조군 혈청 전체보다 높은 것을 확인하였다.
[0050] 실험군 내에서도 각 시료의 질량 스펙트럼이 약간 상이하였으나 검출된 주요 피크는 상이하지 않았고, 대부분의질량 스펙트럼에서 검출 빈도가 낮은 피크를 최소 요구 피크 빈도 매개변수를 통해 MSP로 변환하지 않았다. 따라서, MSP 생성 방법에서 최소 요구 피크 빈도 매개변수를 25%로 설정하여 Biotyper 3에 의해 각 실험군 및 대조군의 혈청 스펙트럼을 통합 MSP로 변환하였다. 이는 통합 MSP 구축을 통해 분류에 불필요한 피크를 제거할 수있다. 매개변수 설정을 통해 통합된 MSP는 빈번하게 검출되는 주요 피크를 포함하며, 이후 통합 MSP를 임상에적용하였다.
[0052] 실험예 3: 임상 적용
[0053] MALDI-MS 분석이 시험 시료(간암 혈청)를 실험군 또는 대조군으로 정확하게 분류할 수 있는지 여부를 확인하였다. 자동 MALDI 분석을 통해 박테리아를 분류하는 데 일반적으로 사용되는 Biotyper-RTC 분석 결과는 점수로 표시되어 진다. 이 실험에서는 통합 MSP와 시료의 스펙트럼을 비교하기 위해 비교 점수를 적용하였다. 점수는 0에서 3의 범위로 표시되며, 점수가 3에 가까울수록 데이터베이스로부터 통합 MSP와 분석된 스펙트럼 사이의 상동성 확률이 높음을 의미한다. 상기 간암 진단을 위한 분류 방법이 신뢰할 만한 결과를 제공할 수 있는지 여부를확인하기 위해 통합 MSP의 검증 시험을 수행하였다.
대조군(n=18)은 간암 진단을 위한 통합 MSP를 검증하기 위해 사용되었다. 대조군 [0054] 시험 세트는 2.558의 높은 평균 매칭 점수 및 0.130의 표준편차로 대조군 혈청 통합 MSP와 일치하였다(하기 표 1 및 표 2 참조). 그러나 이는 1.632의 평균 점수로 간암 혈청 통합 MSP와 일치하였다(표 1). 결과적으로, 통합 MSP의 특이도가 100%임을확인하였으며, 민감도를 확인하기 위해 간암 혈청(n=13) 검사를 이용하여 자동 분류를 실시하였다. 간암 시험세트는 2.271의 평균 매칭 점수 및 0.123의 표준편차로 간암 혈청 통합 MSP와 일치하였다(하기 표 1 및 표 3 참조). 대조군 및 실험군의 분류 점수의 차이는 0.614에서 1.206이었다. 그러나 이는 1.381의 평균 매칭 점수를가지는 대조군의 혈청 통합 MSP와 일치하였다. 상기 결과로부터 간암에 대한 통합 MSP의 민감도를 확인할 수 있었다. 도 4에는 간암 샘플 1(Liver Cacner 1) 및 대조군 혈청 8(Healthy Control 8)의 결과만을 대표로 나타내다.
표 1
[0056]
표 2
[0057]
표 3
[0058]
한편, 실험군 MSP 및 대조군 MSP와 일치하는 매칭 점수의 평균 차이는 실험군 검사 [0059] 세트에서 0.891, 대조군 검사 세트에서 0.926이었다. 상기 점수의 차이는 Bruker 's guideline에 따라 간암을 분류하는데 충분하다고 간주되었고, 미생물 확인을 위하여 0.3 점수 차이에 기초한 식별 정도를 제공한다: 점수 2.3 ~ 3.0: 확률이 매우 높은 종 식별, 2.0 ~ 2.299: 확실한 속 식별 또는 종 식별, 1.7 ~ 1.99: 속 식별, 0.0 ~ 1.69: 신뢰할 수 없는식별. 또한, MALDI 분석을 통한 질량 스펙트럼 패턴, 즉, 강도 및 m/z는 래스터 스팟(raster spot)에 의존하기때문에 MALDI 기반 분류의 재현성이 수행되어야 한다. 따라서 분류를 3회 반복하였고 재현성이 100%임을 확인하였으며, 본 분석방법이 간암 진단을 위한 일관된 결과를 제공할 수 있고, RTC의 시료 준비, MSP 변환 및 분류방법에서도 최적화 되었음을 확인할 수 있었다. 실험군 및 대조군의 혈청 질량 스펙트럼에서 피크 패턴의 분명한 차이가 안정적인 재현성을 만드는 것으로 보이며, 따라서 각 MSP가 얼마나 상이한지를 확인하기 위해 PLS-DA를 수행하였다.
[0061] 실험예 4: 부분 최소 자승 판별 분석(partial least squares discriminant analysis; PLS-DA)

[0062] 부분 최소 자승 판별 분석을 이용하여 실험군 및 대조군 혈청 시료 간의 MALDI-MS 프로파일에서 통계적으로 유의한 차이가 있는지 여부를 확인하였다. 도 5A를 참조하여 보면, 6개의 건강한 대조군 혈청을 제외하고, 실험군및 대조군을 점수 도표의 각 혈청 샘플의 스펙트럼 정보를 가장 많이 확보하는 제 1성분으로 분류하였고, 실험군이 대조군보다 많이 흩어져 있는 것을 확인하였다: 모든 실험군 시료는 음성 점수(약 -20에서 -48)를 보였으나 대조군의 시료는 거의 양성 점수(약 2에서 10)를 나타내었고, 이는 실험군 및 대조군이 서로 분명하게 차별화됨을 의미한다.
[0063] 도 5B는 시험 세트와 통합 MSP의 PLS-DA 플롯을 나타낸 것이다. 결과는 도 5A와 비슷한 패턴을 나타낸다: 대조군-MSP 및 대조군-T(대조군 시험 세트)는 밀집되어 있는 반면, 실험군-MSP 및 실험군-T(실험군 시험 세트)는 광범위하게 흩어져있었다. 맹검 시험에서 각각의 데이터베이스가 가까운 위치에 있음을 확인하였으며, 통계적 결과에서도 실험군 통합 MSP와 대조군 통합 MSP가 완전히 분리되었고, MALDI-MS 프로파일 기반 간암 분류의 결과를 뒷받침하였다.
본 발명에서는 변형된 Biotyper 방법을 사용하여 신뢰할 수 있는 통합 MSP를 [0065] 구축함으로써, 혈청을 기반으로 하는 새로운 간암 진단방법을 개발하였다. 통합 MSP의 유효성을 검사하기 위해, 증류수로 희석한 혈청 시료를 이용하여 30분 이내에 맹검 검사를 완료하였으며, 결과는 점수로 표시되었고, 통합 MSP가 일관된 결과를 제공하는것을 확인하였다. 또한, PLS-DA 분석을 통해 결과는 피크 패턴의 차이로 인한 것임을 확인하였다. 혈청 단백질질량 스펙트럼의 피크 패턴 차이를 반영하고 간암 진단에 적용될 수 있는 통합 MSP의 구축은 혈청을 이용한 간암 진단을 가능하게 한다. 본 진단방법은 종래 진단방법보다 시료 채취가 쉽고, 간단한 준비 과정으로 이루어지며, 신뢰할 수 있는 MSP를 구축한다는 점에서 간암 진단에 적합하다.
[0067] 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[0068] 본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.