TLR4에 LPS와의 경쟁적 결합을 통한 항산화 및 항염증 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 의학적 용도

본 발명은 TLR4에 LPS와의 경쟁적 결합을 통하여 대식세포의 활성을 억제하는 항산화, 항염증의 효과를 갖는 신규화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 화합물들은 항산화 및 항염증 활성을 지니므로 노인성 질병의 예방 또는 염증 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 TLR4-MD2에 LPS와 경쟁적 binding 함으로써 특히, LPS와 경쟁적인 결합을 통하여패혈증, 대사성 질환 또는 심혈관계 질환을 예방하고 치료하는데 유용한 약학조성물 또는 건강식품으로 사용될 수 있다.

청구범위
청구항 1
하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물.
<화학식 2>
<화학식 3>
청구항 2
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청구항 3
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청구항 4
5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(2-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 및 5-(3-브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온으로 이루어진군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 5
제4항에 있어서, 상기 화합물은 TLR4에 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)와의 경쟁적 결합을 통하여 대식세포의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 6
제4항에 있어서, 상기 염증질환은 천식, 기관지염, 패혈증, 관절염, 간염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 궤양성 대장염, 심근염, 다발성 경화증 및 바이러스 감염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 7
5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(2-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 및 5-(3-브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온으로 이루어진군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
청구항 8
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청구항 9
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발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 TLR4에 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)와의 경쟁적 결합을 [0001] 통하여 대식세포의 활성을 억제하는항산화, 항염증 및 항노화의 효과를 갖는 신규화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 염증반응은 체내에서 발생한 산화스트레스에 의해 촉진되는데, 산화스트레스에 의하여 세포 내의 유전자 주성분인 핵산(DNA), 근육의 주성분인 단백질, 세포막의 주성분인 지방 등이 변형을 일으키게 되거나 세포의 활성이떨어져 결국은 신체 기능 자체에 문제가 생기며, 이는 세포사멸뿐만 아니라 퇴행성 질환을 일으키는 특정세포의유전자 발현을 증가시켜 염증 반응을 개시하거나 악화시킨다.
[0003] 평상시 호흡으로 흡수된 산소는 세포 내의 에너지 생산 조직인 미토콘드리아에 들어가 연소하게 되면서 체온유지, 세포활성, 육체활동에 필요한 에너지 (ATP)를 생산하게 된다. 하지만 미토콘드리아의 근본 결함으로 산소는완전 연소가 되지 않아 부산물이 생성되는데 이것이 자유 라디칼(Free radical)인 활성산소이다. 산화스트레스에 대응하기 위해서 생명체는 진화과정을 통해 독성산소를 해독, 파괴 또는 중화하는 방어체계(Defense system)을 갖추고 있는데, 이는 산화/환원(redox)의 밸런스로 균형을 유지하는 체내의 많은 저항요소가 노화되면서파괴적인 활성산소의 힘으로 인해 깨어지고 산화적 파괴로 세포, 조직에 스트레스를 주게 되어 신체기능이 쇠퇴되고 그와 동시에 염증이 생성이 된다.
[0004] 대식세포(macrophage)는 동물 체내 모든 조직에 분포하며 인체 내에서 선천적 면역반응을 담당하는 면역세포로,인체 면역체계에서 중요한 역할을 하는 백혈구이다. 외부의 자극으로 인해 활성화된 대식세포는 염증매개물질분비를 통해 염증반응을 유발함으로써 천식, 기관지염, 관절염, 다발성경화증, 동맥경화증, 뇌졸중, 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 퇴행성뇌질환 및 바이러스 감염으로 인한 염증질환 등을 유발하고, 질환을 악화시키게된다.
[0005] 내독소의 하나인 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)는 Raw264.7 macrophage에서 tumor necrosis factoralpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6), interleukin-1β(IL-1β)와 같은 pro-inflammatory Cytokine을 증가시키며, nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2) 등의 염증매개물질을 분비한다. 염증상태에서는cyclooxygenase-2(COX-2)와 NO synthase(NOS)가 유도되어 과량의 PGE2, NO 등이 생성되며 여러 가지 질병 및암 발병(carcinogenesis)이 촉진된다. 특히 NO를 생성하는 효소인 NOS와 다양한 prostaglandins(PGs)의 생합성을 매개하는 효소인 cyclooxygenase(COX)가 염증반응을 조절하는 중요한 매개체로 알려져 있다.
[0006] 이러한 LPS의 수용체인 Toll like receptor는 산화스트레스와도 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀져 있다. 그중TLR2/TLR4는 주로 박테리아의 외부세포막/세포벽에 있는 지단백(lipoprotein)을 감지하며, 산화스트레스를 일으키는 ROS(활성산소종)를 유도하는 역할을 한다. TLR4의 경우 LPS의 자극에 의해 대식세포가 자극되는 경우에도NF-κB 활성화로 인해 여러 염증인자들이 생성되어 여러 가지 질환의 병리현상을 유도하며 발암과정에도 관여한다. 그러나 생체 내에서는 생성된 활성산소 및 NO, ONOO의 작용을 직접 비활성화시킬 수 있는 내인성 효소가 존재하지 않는 것으로 알려져 있어, 이것을 특이적으로 억제하고 소거하는 항산화제 및 항염증 개발에 관한 연구가 절실히 요구되어 왔다. 이와 같이 세포 독소 물질인 활성산소 및 NO, ONOO에 의한 손상으로부터 세포를 보호하기 위하여 ONOO 소거 활성을 갖는 항산화제 개발에 관한 연구가 진행되어 왔으며, 천연물 유래 또는 합성 소거제가 다수 개발되어있다.
항산화제는 산소를 제거하거나 흡수하는게 아니라 자유라디칼과 반응함으로써 [0007] 특정 비타민류와 필수 아미노산의손실을 최소화하거나, 유지 제품의 산패를 지연 또는 방지하는 목적으로 사용된다. 식품 또는 의약품 등에 많이사용되는 합성 항산화제로는 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA, Butylated hydroxyanisole), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT, Butylated hydroxytoluene), 프로필 갈레이트 (PG, Propyl galate), 터셔리부틸 하이드로퀴논(TBHQ, Tertiary butyl hydroquinone) 등이 있으나, 이들을 실험동물에 고농도로 투여할 경우에는 간 비대증이유발되거나 발암성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 특히 부틸화 하이드록시톨루엔은 여러 연구 결과를 통하여실험동물의 간에서 마이크로솜 효소 활성 (microsomal enzyme activity)을 증가시킨다는 것이 알려지면서, 이들페놀계 합성 항산화제의 안전성에 대하여 논란이 제기되어 현재에는 그 사용량이 법적으로 규제되어 있다. 이에따라 항산화 효과가 높으면서 안전하고 경제적인 식물기원의 천연 항산화제를 개발하고자 하는 많은 연구가 기대 속에 이루어지고 있다.
[0008] 최근 천연물을 대상으로 한 연구 중 특히, 항산화성 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 현재까지 알려진 천연 항산화 물질로는 토코페롤류 (tocopherol), 플라보노이드류 (flavonoid), 고시폴 (gossypol), 세사몰 (sesamol), 오리자놀 (oryzanol) 및 비타민 C 등을 들 수 있다. 이 중 토코페롤 (tocopherol)과 L-아스코르브산 (L-ascorbic acid)이 천연 항산화제로 선호되고 있는데, 그 중 토코페롤은 안전성이 높으나 단독으로는 산화반응 저지 능력이 낮으며, 가격이 비싸다는 단점이 있다.
[0009] 직접 TLR4와 결합하는 TLR4 antagonist는 거의 보고된 바가 없으나, 그 중 대표적인 물질로 에리토란(eritoran)은 2009년 말 일본의 Eisai사에서 만들어진 것으로 TLR4의 MD2에 결합하여 그에 관한 신호전달기작들을 억제하여 패혈증 환자들의 치료에 목적을 두고,임상 3상에 돌입한 것으로 보고하고 있다. 하지만 분자량이 매우 크기 때문에 에리토란(eritoran)의 대량생산에는 어려움이 있다.
선행기술문헌
특허문헌
[0010] (특허문헌 0001) 한국공개특허 10-2011-0119279(2011.11.02 공개)
발명의 내용
해결하려는 과제
[0011] 본 발명의 목적은 TLR4에 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)와의 경쟁적 결합을 통하여 대식세포의 활성을억제하는 항산화, 항염증 및 항노화의 효과를 갖는 신규화합물을 제공하는 데에 있다.
[0012] 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
[0013] 또한, 본 발명의 또 다른 목적은 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용, 항산화용또는 항노화용 건강기능식품을 제공하는 데에 있다.
과제의 해결 수단
[0014] 상기 과제의 해결을 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[0015] <화학식 1>
[0016]
상기 화학식 1에서, R1 내지 R4는 각각 같거나 다를 수 있으며, H, OH, Br 또는 [0017] C1 내지 C4의 알콕시 중 어느하나이고, X는 O 또는 S임.
[0018] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
[0019] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[0020] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.
[0021] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.
발명의 효과
[0022] 본 발명은 TLR4에 LPS와의 경쟁적 결합을 통한 항산화 및 항염증 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 화합물들은 TLR4에 LPS와의 경쟁적 결합을 통해서 대식세포의 활성을 억제하는 소분자로서, 염증 반응 시 분비되는 염증유발인자와 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 생성 및증매개물질 (NO, ONOO-)과 염증유발 유전자 (Cox-2, iNOS)의 발현을 억제하고, 또한 이러한 염증을 조절하는전사인자(NF-κB)의 활성을 억제함으로써, 항산화와 항염증 작용을 가지며 보다 효과적인 항노화 효과를 나타낸다. 덧붙여서 본 실험은 C57BL/6 mice의 liver에서도 검증하였다. 그러므로, 본 신규화합물은 패혈증, 대사성질환 또는 심혈관계 질환을 예방하고 치료하는데 있어, 부작용이 적고 안전한 의약품 또는 건강식품 등 다양한분야에서 활용 가능하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 TLR4 억제를 표적으로 하는 화합물들로써, ROS 및 ONOO
-
[0023] 의 스크리닝(screening)을 통한 억제 효과를 가지는 물질들에 대한 그래프이다.
도 2는 도킹 시뮬레이션을 통해서 본 발명에 따른 화합물이 TLR4의 MD2 부분에 결합하여 LPS와 경쟁적 결합을한다는 그림이다.
도 3은 본 발명의 신규 화합물인 42번, 50번 화합물이 세포 생존능 분석(cell viability assay)을 통해서 1μM~10μM의 농도에서 세포독성에 안정적이라는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 대식세포에서 LPS에 의해 증가된 산화스트레스(ROS, ONOO
-
, NO)가 본 42번, 50번 화합물에 의해 감소된다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 형광 염료를 통해서 대식세포에서 LPS에 의해 증가된 ROS, ONOO
-
가 본 42번, 50번 화합물에 의해 감소
된다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 42번, 50번 화합물을 처리함으로써 LPS에 의해 증가된 염증 유도 단백질인 COX-2와 iNOS의 발현이 억제되는 그림이다.
도 6은 산화스트레스와 염증 관련 단백질의 전사인자인 NF-κB의 발현 및 활성을 나타낸 그림으로써, P65의 인산화 사이트(phosphorylation site) 중 ser536번의 NF-κB 인산화(phosphorylation)의 활성이 42번, 50번 화합물에 의해 억제되는 그림이다.
도 7은 대식세포에서 NF-κB의 활성을 나타낸 것으로, 42번, 50번 화합물에 의해 NF-κB의 이동(translocation)이 억제되는 효과에 대한 그림이다.
도 8은 NF-κB 결합 부위가 접합된(ligation) 루시퍼라아제 리포터 벡터(luciferase reporter vector)를 사용하여, 핵 내로 이동(translocation)의 효과를 나타내는 것으로서, LPS에 의해 증가된 NF-κB의 활성화가 42번과50번 화합물에 의해 농도 의존적으로 억제하는 그림이다.
도 9는 42번과 50번 화합물을 처리한 물질에서 모두 농도 의존적으로 IKKB의 활성과 IκBα의 활성이 떨어짐으로써 NF-κB의 핵 내로 이동(translocation)의 억제 효과에 대한 그림이다.
도 10은 NF-κB의 상위 신호전달체계에서 IKK에 직접적으로 영향을 미치는 AKT의 활성을 측정하였을 때, 농도의존적으로 42번, 50번 화합물에 의해 AKT 활성의 억제효과와 이를 조절하는 PTEN과 NOX4도 또한 농도 의존적으로 42번, 50번 화합물에 의해 억제되는 그림이다.
도 11은 대식세포에서의 산화스트레스 억제효과를 동물모델에서 확인하기 위하여, C57BL/6의 간과 혈액을 채취하여 ROS와 ONOO
-
측정하였다. ROS와 ONOO
-
는 LPS군 마우스에서는 간과 혈액 모두에서 증가하였으며, 42번 화합물과 50번 화합물에서 농도 의존적으로 감소하는 그림이다.
도 12는 C57BL/6의 간에서 염증과 관련된 중요한 전사인자인 NF-κB의 인산화(phosphorylation)와 발현을 확인하였다. LPS에서 증가된 P65와 P65의 인산화(phosphorylation)는 42번과 50번 화합물에서 감소하였으며, 또한전-염증 유전자(pro-inflammatory gene)인 COX-2에서도 발현이 감소하였으며, iNOS도 mRNA 수준에서 COX-2와같은 경향을 보이는 그림이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은 Raw264.7 macrophage에서 산화스트레스의 소거능을 가진 작은 분자량의 [0024] 화합물들로서 TLR4에 직접적인 결합을 하여 LPS와의 경쟁적 결합을 통해 LPS 자극 시 증가되는 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α),interleukin-6(IL-6), interleukin-1β(IL-1β)와 같은 pro-inflammatory Cytokine을 억제시키며, nitricoxide(NO), prostaglandin E2(PGE2) 등의 염증매개물질 분비를 억제한다. 또한 염증을 유도하는 전사인자인NF-κB의 핵으로의 전사를 억제함으로써 AKT 신호전달기작을 차단하여 이에 유발되는 cycloxygenase-2(COX-2)와NO synthase(NOS)와 과량의 PGE2, NO 등의 생성을 억제하여 패혈증과 관련된 여러 가지 질병 및 암 발병(carcinogenesis)을 예방하고자 한다.
[0025] 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[0026] <화학식 1>
[0027]
[0028] 상기 화학식 1에서, R1 내지 R4는 각각 같거나 다를 수 있으며, H, OH, Br 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느하나이고, X는 O 또는 S임.
[0029] 바람직하게는, 상기 화합물은 5-(4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온,5-(3,4-디하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(2,4-디하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(4-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(3,4-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(2,4-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(3,4,5-트리메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온, 5-(4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3,4-디하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(2,4-디하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3,4-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(2,4-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(2-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3,4,5-트리메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온, 5-(3-브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 또는 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0030] 보다 바람직하게는, 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온(화합물 42) 또는 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온(화합물 50)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0031] <화학식 2>
[0032]
[0033] <화학식 3>
[0034]
[0035] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[0036] 바람직하게는, 상기 화합물은 TLR4에 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)와의 경쟁적 결합을 통하여 대식세포의 활성을 억제할 수 있다.
[0037] 바람직하게는, 상기 염증질환은 천식, 기관지염, 패혈증, 관절염, 간염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 궤양성대장염, 심근염, 다발성 경화증 또는 바이러스 감염일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0038] 본 발명의 약학적 조성물인 경우, 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를포함할 수 있는데, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스,덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다.
[0039] 상기 약학적 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다.
또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
[0040] 상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
[0041] 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.
[0042] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[0043] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.
[0044] 또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 건강기능식품을 제공한다.
[0045] 본 발명에서, "건강기능식품"이란 질병의 예방 및 치료, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절
기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.
[0046] 한편, 본 발명의 건강기능식품은 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며,그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 [0047] 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다.
[0048] 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[0049] <실시예 1> 화합물 1 내지 12 합성
[0050] 하기 표 1은 5-(치환된 벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 유사체 [5-(substitutedbenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione analog] 화합물 1-12의 치환 패턴을 설명하기 위한 것이다.
[0051] <화학식 4>
[0052]
표 1
[0053] 화합물
R
1
R
2
R
3
R
4
1 H H OH H
2 H OH OH H
3 OH H OH H
4 H OMe OH H
5 H OEt OH H
6 H OH OMe H
7 H H OMe H
8 H OMe OMe H
9 OMe H OMe H
10 H OMe OMe OMe
11 H OMe OH OMe
12 H Br OH Br
[0054] OMe는 메톡시, OEt는 에톡시기를 나타냄.
[0055] 5-(치환된 벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 유사체 [5-(substituted benzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione analog] 화합물인 화합물 1 내지 12는 다음과 같이 합성하였다. 즉, EtOH (4 mL) 및H2O(4mL) 용매에서 치환된 벤즈알데히드 (benzaldehyde) (1.44 ~ 2.60 mmol) 및 바르비투르산(barbituricacid) (0.7 ~ 1.2 당량(eq.))의 현탁액을 80 ℃로 가열하였다. 상기 반응 온도가 80 ℃에 도달하기 전에, 대부의 경우 상기 반응 혼합물은 깨끗한 용액이 되었다. 그런데, 가열을 더 하는 동안 (1~18 시간), 침전물이 형성되었고, 냉각 후에 침전물을 여과하였다. 화합물 12합성의 경우에는 80 ℃가 아닌 실온에서 반응시켰으며 실온에서 위와 동일한 조작을 하였다. 상기 남아있는 치환된 벤즈알데히드의 특성을 고려하여, 여과 케이크를 에탄올(ethanol) 및/또는 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride) 및 물로 세정하여 목적 생성물을 얻었다(수율:60.3~99.4%).
[0056] 1. 5-(4-하이드록시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 1) 합성
노란색 고체; 반응시간, 6 시간; 수율, 82.6%; 녹는점, >300 ℃;1
[0057] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 11.23 (s, 1 H),
11.10 (s, 1 H), 10.79 (s, 1 H), 8.29 (d, 2 H, J=8.8Hz), 8.17(s, 1H), 6.84(d, 2H, J=8.8Hz);
13
C
NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 164.8, 163.7, 163.0, 156.1, 150.9, 139.0, 124.4, 116.2, 114.9; LRMS(ESI) m/z
231(M-H)
-
.
2. 5-(3,4-디하이드록시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4-Dihydroxybenzylidene)

[0058] pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 2) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 8 시간; 수율, 99.3%; 녹는점, >300 ℃;1
[0059] H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 11.14 (br s, 2
H), 9.76 (br s, 1 H), 9.55 (br s, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.61 (d, 1 H, J=8.0Hz), 6.83(d,
1H, J=7.5Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 164.9, 162.9, 156.7, 153.0, 150.9, 145.5, 132.0, 124.9,
122.0, 116.0, 114.3; LRMS(ESI) m/z 247(M-H)
-
.
[0060] 3. 5-(2,4-디하이드록시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(2,4-Dihydroxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 3) 합성노란색 고체; 반응시간, 10 시간; 수율, 60.3%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0061] H NMR(500MHz, D2O+NaOH) δ 8.07 (s, 1 H),
7.26 (d, 1 H, J=8.5Hz), 6.44(dd, 1H, J=2.0, 9.0Hz), 6.24(s, 1H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 168.5,
166.7, 162.2, 157.2, 156.8, 145.7, 134.0, 116.5, 113.1, 109.8, 103.3; LRMS(ESI) m/z 247(M-H)
-
.
[0062] 4. 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxy-3-methoxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 4) 합성농황색 고체; 반응시간, 18 시간; 수율, 97%; 녹는점, 288.6-290.7 ℃;
1
[0063] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.23
(s, 1 H), 11.11 (s, 1 H), 10.54 (s, 1 H), 8.44 (d, 1 H, J=2.0Hz), 8.18(s, 1H), 7.77(dd, 1H, J=2.0,
8.4Hz), 6.86(d, 1H, J=8.4Hz), 3.79 (s, 3 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 164.8, 163.2, 156.6, 153.7,
150.9, 147.6, 133.2, 124.9, 118.6, 116.0, 114.6, 56.2; LRMS(ESI) m/z 261(M-H)
-
.
[0064] 5. 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3-Ethoxy-4-
hydroxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 5) 합성
오렌지색 고체; 반응시간, 15 시간; 수율, 77%; 녹는점, 244.7-246.1 ℃;
1
[0065] H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 11.24
(s, 1 H), 11.11 (s, 1 H), 10.46 (s, 1 H), 8.48 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.74 (d, 1 H, J=8.5Hz),
6.90(d, 1H, J=8.5Hz), 4.08(q, 2H, J=7.0Hz), 1.36(t, 3H, J=7.0Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 164.8,
163.1, 156.6, 154.0, 150.8, 146.8, 133.2, 124.9, 119.7, 116.1, 114.6, 64.5, 15.2; LRMS(ESI) m/z 275(MH)
-
.
[0066] 6. 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3-Hydroxy-4-methoxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 6) 합성농황색 고체; 반응시간, 17 시간; 수율, 93%; 녹는점, 279.3-281.4 ℃;
1
[0067] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.26
(s, 1 H), 11.13 (s, 1 H), 9.42 (s, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.70 (d, 1 H, J=8.5Hz), 7.03(d,
1H, J=9.0Hz), 3.87(s, 3H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 164.7, 162.8, 156.2, 153.6, 150.9, 146.4,
131.0, 126.1, 121.1, 115.7, 112.0, 56.4; LRMS(ESI) m/z 261(M-H)
-
.
[0068] 7. 5-(4-메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Methoxybenzylidene)pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 7) 합성노란색 고체; 반응시간, 13 시간; 수율, 93%; 녹는점, 292.4-294.3 ℃;1
[0069] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 11.27 (s,
1 H), 11.14 (s, 1 H), 8.33 (d, 2 H, J=9.2Hz), 8.21(s,1H), 7.02(d, 2H, J=8.8Hz), 3.83(s, 3H);
13
C
NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 164.6, 164.1, 162.8, 155.6, 150.9, 138.1, 125.8, 116.2, 114.6, 56.4; LRMS(ESI)
m/z 245(M-H)
-
.
8. 5-(3,4-디메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4-Dimethoxybenzylidene)[0070] pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 8) 합성
노란색 고체; 반응시간, 9 시간; 수율, 96.6%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0071] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 11.27 (s, 1 H),
11.15 (s, 1 H), 8.37 (d, 1 H, J=2.0Hz), 8.21(s, 1H), 7.86(dd, 1H, J=2.0,8.4Hz), 7.07(d, 1H, J=8.4Hz),
3.84(s, 3H), 3.77(s, 3H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 164.7, 163.0, 156.1, 154.3, 150.9, 148.5, 132.4,
125.9, 117.4, 115.9, 111.8, 56.5, 56.1; LRMS(ESI) m/z 275(M-H)
-
.
[0072] 9. 5-(2,4-디메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(2,4-Dimethoxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 9) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 8 시간; 수율, 97%; 녹는점, 291.1-291.7 ℃;
1
[0073] H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (s,
1 H), 11.06 (s, 1 H), 8.61 (s, 1 H), 8.53 (d, 1 H, J=8.5Hz), 6.63(d, 1H, J=2.0Hz), 6.61(dd, 1H,
J=2.0,9.0Hz), 3.90(s, 3H), 3.87(s, 3H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 166.5, 164.8, 163.1, 162.8, 150.9,
149.7, 136.1, 115.3, 114.9, 106.5, 98.1, 56.9, 56.5; LRMS(ESI) m/z 275(M-H)
-
.
[0074] 10. 5-(3,4,5-트리메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4,5-Trimethoxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 10) 합성
노란색 고체; 반응시간, 1 시간; 수율, 84.0%; 녹는점, 274.8-275.4 ℃;1

[0075] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 11.33 (s,
1 H), 11.20 (s, 1 H), 8.22 (s, 1 H), 7.80 (s, 2 H), 3.78 (s, 6 H), 3.75 (s, 3 H);
13
C NMR(100MHz, DMSOd6)
δ 164.4, 162.8, 155.9, 152.6, 150.8, 142.6, 128.2, 117.9, 113.3, 61.0, 56.7; LRMS(ESI) m/z 305(MH)
-
.
[0076] 11. 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 11) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 2 시간; 수율, 99.4%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0077] H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 11.25 (s, 1
H), 11.12 (s, 1 H), 9.97 (br s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 8.00 (s, 2 H), 3.82 (s, 6 H);
13
C NMR(100MHz,
DMSO-d6) δ 164.8, 163.2, 157.0, 150.9, 147.8, 143.1, 123.5, 114.9, 114.6, 56.7; LRMS(ESI) m/z 291(MH)
-
.
[0078] 12. 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,5-Dibromo-4-hydroxybenzylidene)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 12) 합성
노란색 고체; 반응시간, 10 시간; 수율 81.7%;
1
[0079] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 11.33 (s, 1 H), 11.22 (s, 1 H),
8.54 (s, 2 H), 8.10 (s, 1 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 164.0, 162.7, 155.5, 152.4, 150.8, 139.0,
127.1, 118.2, 111.4.
[0080] <실시예 2> 화합물 13 내지 26 합성
[0081] 하기 표 2는 5-(치환된 벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 유사체 [5-(substitutedbenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione analog] 화합물 13-26의 치환 패턴을 설명하기 위한 것이다.
[0082] <화학식 5>
[0083]
표 2
[0084] 화합물
R
1
R
2
R
3
R
4
13 H H OH H
14 H OH OH H
15 OH H OH H
16 H OMe OH H
17 H OEt OH H
18 H OH OMe H
19 H H OMe H
20 H OMe OMe H
21 OMe H OMe H
22 OH H H H
23 H OMe OMe OMe
24 H OMe OH OMe
25 H Br OH H
26 H Br OH Br
[0085] OMe는 메톡시, OEt는 에톡시기를 나타냄.
[0086] 5-(치환된 벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 유사체 [5-(substituted benzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione analog] 화합물 13-26은 다음과 같이 합성하였다. 즉, 에탄올 (4 ~8 mL) 및 H2O (4 ~ 8 mL) 용매에서 치환된 벤즈알데히드(1.52 ~ 1.97 mmol) 및 티오바르비투르산(thiobarbituric acid) (0.9 ~ 1.1 당량(eq.))의 현탁액을 80 ℃로 가열하였다. 상기 반응 온도가 80 ℃에 도달하기 전에, 상기 반응 혼합물을 대부분의 경우에서 깨끗한 용액이 되었다. 그런데, 추가적인 가열 (5 분 ~10.5 시간) 동안에, 침전물이 형성되었고, 냉각한 후에, 침전물을 여과하였다. 화합물 25 및 26합성의 경우에는80 ℃가 아닌 실온에서 반응시켰으며 실온에서 위와 동일한 조작을 하였다. 남아있는 치환된 벤즈알데히드의 특성을 고려하여, 여과 케이크를 에탄올 및/또는 메틸렌 클로라이드 및 물로 세정하여 화합물 13 - 26 (수율:46.9 ~ 99.5 %)을 얻었다.
[0087] 1. 5-(4-하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 13) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 3 시간; 수율, 96%; 녹는점, 291.7-293.5 ℃;
1
[0088] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.30 (s,
1 H), 12.20 (s, 1 H), 10.93 (s, 1 H), 8.34 (d, 2 H, J=8.8Hz), 8.19(s, 1H), 6.86(d, 2H, J=8.8Hz);
13
C
NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.8, 164.4, 163.1, 160.7, 157.2, 139.5, 124.6, 116.4, 114.9; LRMS(ESI) m/z
247(M-H)
-
.
[0089] 2. 5-(3,4-디하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,4-Dihydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 14) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 3 시간; 수율, 99.5%; 녹는점, >300 ℃;1

[0090] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.28 (s, 1
H), 12.19 (s, 1 H), 10.55 (br s, 1 H), 9.56 (br s, 1 H), 8.25 (s, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.63 (d, 1 H,
J=8.4Hz), 6.83(d, 1H, J=8.4Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.8, 163.2, 160.7, 157.7, 153.9, 145.7,
132.9, 125.2, 122.1, 116.2, 114.3; LRMS(ESI) m/z 263(M-H)
-
.
3. 5-(2,4-디하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6([0091] 1H,5H)-디온[5-(2,4-Dihydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 15) 합성농황색 고체; 반응시간, 5 분; 수율, 82.5%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0092] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.16 (s, 1 H),
12.06 (s, 1 H), 11.00 (s, 1 H), 10.89 (br s, 1 H), 8.77 (d, 1 H, J=8.8Hz), 8.76(s, 1H), 6.37(d, 1H,
J=1.6Hz), 6.31(dd, 1H, J=2.0, 9.2Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.6, 167.3, 164.8, 163.6, 161.0,
151.2, 137.3, 113.5, 111.9, 109.1, 102.1; LRMS(ESI) m/z263(M-H)
-
.
[0093] 4. 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxy-3-methoxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 16) 합성빨강색 고체; 반응시간, 3 시간; 수율, 98.8%; 녹는점, 260.9-263.6 ℃;
1
[0094] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.31 (s,
1 H), 12.20 (s, 1 H), 10.70 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.83 (d, 1 H, J=8.8Hz), 6.88(d,
1H, J=8.4Hz), 3.80(s, 3H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.7, 163.1, 160.9, 157.6, 154.5, 147.7, 133.9,
125.1, 118.9, 116.2, 114.7, 56.2; LRMS(ESI) m/z 277(M-H)
-
.
[0095] 5. 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Ethoxy-4-hydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 17) 합성연한 오렌지색 고체; 반응시간, 3 시간; 수율, 88.5%; 녹는점, 285.0-287.3 ℃;
[0096] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ
12.30 (s, 1 H), 12.19 (s, 1 H), 10.65 (br s, 1 H), 8.47 (d, 1 H, J=2.0Hz), 8.19(s, 1H), 7.78(dd, 1H,
J=2.0, 8.4Hz), 6.89(d, 1H, J=8.4Hz), 4.05(q, 2H, J=7.2Hz), 1.33(t, 3H, J=7.2Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSOd6)
δ 178.7, 163.1, 160.9, 157.7, 154.8, 146.9, 134.0, 125.1, 119.8, 116.2, 114.6, 64.5, 15.2;
LRMS(ESI) m/z 291(M-H)
-
.
[0097] 6. 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Hydroxy-4-methoxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 18) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 8 시간; 수율, 97%; 녹는점, 278.9-280.5 ℃;1
[0098] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.32 (s,
1 H), 12.23 (s, 1 H), 9.58 (br s, 1 H), 8.16 (d, 1 H, J=2.0Hz), 8.13(s, 1H), 7.73(dd, 1H, J=2.0Hz,
8.4Hz), 7.04(d, 1H, J=8.8Hz), 3.86(s, 3H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 178.9, 163.0, 160.6, 157.3,
154.2, 146.6, 131.8, 126.2, 121.2, 115.7, 112.1, 56.6; LRMS(ESI) m/z 277(M-H)
-
.
[0099] 7. 5-(4-메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Methoxybenzylidene)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 19) 합성
노란색 고체; 반응시간, 4 시간; 수율, 77.9%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0100] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1 H),
12.25 (s, 1 H), 8.38 (d, 2 H, J=8.8Hz), 8.23(s, 1H), 7.04(d, 2H, J=9.2Hz), 3.85(s, 3H);
13
C NMR(100MHz,
DMSO-d6) δ 179.0, 164.7, 162.9, 160.6, 156.6, 138.6, 126.0, 116.3, 114.8, 56.5; LRMS(ESI) m/z 261(MH)
-
.
[0101] 8. 5-(3,4-디메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,4-Dimethoxybenzylidene)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 20) 합성
농황색 고체; 반응시간, 4 시간; 수율, 91.9%; 녹는점, 269.9-271.7 ℃;
1
H NMR(500MHz, DMSO-[0102] d6) δ 12.37 (s,
1 H), 12.26 (s, 1 H), 8.41 (s, 1 H), 8.26 (s, 1 H), 7.95 (d, 1 H, J=8.5Hz), 7.12(d, 1H, J=8.5Hz),
3.88(s, 3H), 3.80(s, 3H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.8, 163.0, 160.8, 157.2, 154.9, 148.5, 133.0,
126.1, 117.6, 116.0, 111.9, 56.6, 56.1; LRMS(ESI) m/z 291(M-H)
-
.
[0103] 9. 5-(2,4-디메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(2,4-Dimethoxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 21) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 4 시간; 수율, 98.4%; 녹는점, 294.1-295.4 ℃;
1
[0104] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.27
(s, 1 H), 12.16 (s, 1 H), 8.62 (s, 1 H), 8.61 (d, 1 H, J=8.4Hz), 6.61(s, 1H), 6.60(d, 1H, J=8.0Hz),
3.89(s, 3H), 3.86(s, 3H);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 178.9, 167.3, 163.6, 163.1, 160.6, 150.5, 136.5,
115.1, 115.1, 106.9, 98.1, 57.1, 56.7; LRMS(ESI) m/z 291(M-H)
-
.
[0105] 10. 5-(2-하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(2-Hydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 22) 합성연한 노란색 고체; 반응시간, 4 시간; 수율, 65.9%; 녹는점, 250.6-251.4 ℃;
1
[0106] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ
11.40 (s, 1 H), 9.75 (s, 1 H), 9.60 (s, 1 H), 9.00 (s, 1 H), 8.01 (dd, 1 H, J=2.0, 8.0Hz), 7.79(td,
1H, J=2.0, 8.0Hz), 7.52(d, 1H, J=8.4Hz), 7.44(td, 1H, J=0.8,7.6Hz);
13
C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ 181.2,
161.7, 161.1, 154.9, 150.7, 136.1, 131.5, 126.2, 119.0, 118.1, 117.1; LRMS(ESI) m/z 247(M-H)
-
.
[0107] 11. 2-티옥소-5-(3,4,5-트리메톡시벤질리덴)디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[2-Thioxo-5-(3,4,5-trimethoxybenzylidene)dihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 23) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 1 시간; 수율, 65.5%; 녹는점, 258.9-260.7 ℃;
1
[0108] H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 12.41
(s, 1 H), 12.30 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 7.85 (s, 2 H), 3.79 (s, 6 H), 3.77 (s, 3 H);
13
C NMR(100MHz,
DMSO-d6) δ 179.0, 162.7, 160.6, 156.8, 152.6, 143.2, 128.3, 118.0, 113.6, 61.0, 56.7; LRMS(ESI) m/z
321(M-H)
-
.
[0109] 12. 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 24) 합성오렌지색 고체; 반응시간, 2 시간; 수율, 97.5%; 녹는점, >300 ℃;
1
[0110] H NMR(500MHz, DMSO-d6) δ 12.33 (s, 1
H), 12.23 (s, 1 H), 10.17 (br s, 1 H), 8.27 (s, 1 H), 8.05 (s, 2 H), 3.83 (s, 6 H);
13
C NMR(100MHz,
DMSO-d6) δ 178.7, 163.2, 160.9, 158.0, 147.9, 144.0, 123.7, 115.0, 114.9, 56.7; LRMS(ESI) m/z 307(MH)
-
.
[0111] 13. 5-(3-브로모-4-하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Bromo-4-hydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 25) 합성노란색 고체; 반응시간, 10 시간; 수율, 46.9%;
1
[0112] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 12.35 (s, 1 H), 12.26 (s, 1
H), 11.75 (br s, 1 H), 8.87 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 8.13 (s, 1 H), 8.07 (dd, 1 H, J = 2.0, 8.4 Hz), 7.00
(d, 1 H, J = 8.4 Hz);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 178.9, 162.7, 160.7, 160.1, 155.3, 140.3, 138.5,
125.9, 116.5, 116.5, 110.2.
[0113] 14. 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,5-Dibromo-4-hydroxybenzylidene)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 26) 합성노란색 고체; 반응시간, 10.5 시간; 수율 55.9%;
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 12.38 ([0114] s, 1 H), 12.28 (s, 1
H), 8.60 (s, 2 H), 8.09 (s, 1 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 179.0, 162.4, 160.6, 156.1, 153.3,
139.4, 127.1, 118.1, 111.6.
[0115] <실시예 3> 화합물 27 내지 38 합성
[0116] 하기 표 3은 5-(치환된 벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 유사체 [5-(substituted benzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione analog] 화합물 27-38의 치환 패턴을 설명하기 위한 것이다.
[0117] <화학식 6>
[0118]
표 3
[0119] 화합물
R
1
R
2
R
3
R
4
27 H H OH H
28 H OH OH H
29 OH H OH H
30 H OMe OH H
31 H OEt OH H
32 H OH OMe H
33 H H OMe H
34 H OMe OMe H
35 OMe H OMe H
36 H OMe OMe OMe
37 H OMe OH OMe
38 H Br OH Br
[0120] 5-(치환된 벤질리덴)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온 (화합물 1-12에 해당, 30 mg)이 에탄올 (5 mL)에 현탁되어 있는 0 ℃ 현탁 용액 속으로 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4,3 당량)를 천천히 부가하고 그 혼합용액을 실온에서 0.5 - 4 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 휘발시키고 물을 부가한 후 1N-염산(HCl)으로 pH를 7로 맞췄다. 물을 감압 하에서 휘발시킨 다음, 에테르/물 (5 ~ 10 : 1) 또는 에탄올/물 (5:1, 화합물 35의 경우)을 부가하고 생성된 고체를 여과하고 에테르/물 (5 ~ 10 : 1) 또는 에탄올/물 (5:1, 화합물 35의 경우)로 세척하여 목적 생성물을 고체로 얻었다.
[0121] 1. 5-(4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-rione](화합물 27) 합성
반응시간, 3 시간; 수율, 51.5%;1
[0122] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 11.10 (s, 2 H), 9.25 (s, 1 H), 6.84 (d, 2 H,
J = 8.0 Hz), 6.61 (d, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.73 (t, 1 H, J = 4.5 Hz), 3.13 (d, 2 H, J = 4.5 Hz);
13
C NMR
(100 MHz, DMSO-d6) d 170.8, 156.8, 151.2, 130.6, 127.6, 115.7, 50.3, 33.9; LRMS(ESI) m/z 233 (M-H)-
.
[0123] 2. 5-(3,4-디하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4-Dihydroxybenzyl)pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 28) 합성반응시간, 4 시간; 수율, 56.2%;
1
H NMR (400 MHz, D2O) d 6.64 (br d, 1 H, J = 8.0 [0124] Hz), 6.61 (s, 1 H),
6.52 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.29 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 166.7, 153.3, 143.9, 141.7, 135.3,
120.0, 116.3, 115.7, 89.5, 26.9; LRMS(ESI) m/z 249 (M-H)
-
.
[0125] 3. 5-(2,4-디하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(2,4-Dihydroxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 29) 합성반응시간, 3 시간; 수율, 83.3%;1
[0126] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11.64 (s, 1 H), 10.94 (s, 2 H), 9.69 (s, 1
H), 7.02 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 6.53 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 6.36 (s, 1 H), 3.41 (s, 1 H), 3.32 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 164.8, 157.7, 154.4, 150.3, 131.1, 113.4, 110.3, 103.3, 84.8, 20.4;
LRMS(ESI) m/z 249 (M-H)
-
.
[0127] 4. 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 30) 합성반응시간, 2 시간; 수율, 26.8%;1
[0128] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.79 (s, 1 H), 6.69 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 6.62
(d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.71 (s, 3 H), 3.40 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 166.7, 153.4, 147.3,
142.6, 135.1, 120.4, 115.5, 112.3, 89.5, 56.0, 27.2; LRMS(ESI) m/z 263 (M-H)
[0129] 5. 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3-Ethoxy-4-hydroxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 31) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 30.8%;
1
[0130] H NMR (400 MHz, D2O) d 6.73 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 6.65 (d, 1 H, J = 8.0
Hz), 6.58 (dd, 1 H, J = 2.0, 7.6 Hz), 3.93 (q, 2 H, J = 6.8 Hz), 3.33 (s, 2 H), 1.19 (t, 3 H, J = 6.8Hz);13
C NMR (100 MHz, D2O) d 166.7, 153.3, 146.2, 142.9, 135.1, 120.6, 115.5, 113.8, 89.5, 65.3, 27.1,14.1; LRMS(ESI) m/z 277 (M-H)
-
.
[0131] 6. 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3-Hydroxy-4-methoxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 32) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 23.1%;
1
[0132] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 11.11 (s, 2 H), 8.85 (s, 1 H), 6.73 (d, 1 H,
J = 7.6 Hz), 6.48 (s, 1 H), 6.40 (d, 1 H, J = 7.2 Hz), 3.74 (br s, 1 H), 3.66 (s, 3 H), 3.08 (br s, 2
H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 170.7, 151.3, 147.1, 146.8, 130.1, 120.2, 117.0, 112.7, 56.2, 50.1,
33.7; LRMS(ESI) m/z 263 (M-H)
-
.
[0133] 7. 5-(4-메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Methoxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 33) 합성
반응시간, 3 시간; 수율, 67.9%;
1
[0134] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 11.14 (s, 2 H), 6.98 (d, 2 H, J = 8.0 Hz),
6.80 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 3.80 (t, 1 H, J = 3.5 Hz), 3.69 (s, 3 H), 3.19 (d, 2 H, J = 3.5 Hz);
13
C NMR
(100 MHz, DMSO-d6) d 170.7, 158.7, 151.2, 130.7, 129.6, 114.4, 55.6, 50.2, 33.5; LRMS(ESI) m/z 247 (MH)
-
.
[0135] 8. 5-(3,4-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4-Dimethoxybenzyl)pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 34) 합성
반응시간, 30 분; 수율, 39.7%;
1
[0136] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.80 (s, 1 H), 6.79 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 6.70
(d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.69 (s, 3 H), 3.67 (s, 3 H), 3.40 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 166.7,
153.3, 148.0, 146.1, 135.7, 120.1, 112.1, 111.8, 89.4, 55.9, 55.7, 27.2; LRMS(ESI) m/z 277 (M-H)
-
.
9. 5-(2,4-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(2,4-Dimethoxybenzyl)[0137] pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 35) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 87.7%;
1
[0138] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 9.27 (s, 2 H), 6.77 (d, 1 H, J = 8.0 Hz),
6.40 (s, 1 H), 6.29 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.73 (s, 3 H), 3.66 (s, 3 H), 3.37 (s, 1 H), 3.22 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 165.6, 158.5, 158.4, 153.0, 128.9, 124.3, 104.3, 98.1, 82.6, 55.7, 55.7,
22.2; LRMS(ESI) m/z 277 (M-H)
-
.
[0139] 10. 5-(3,4,5-트리메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,4,5-Trimethoxybenzyl)pyrimidine-
2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 36) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 82.8%;
1
[0140] H NMR (400 MHz, D2O) d 6.45 (s, 2 H), 3.65 (s, 6 H), 3.56 (s, 3 H),
3.37 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 166.7, 153.3, 152.3, 139.5, 134.6, 105.3, 89.0, 61.1, 56.1,
28.1; LRMS(ESI) m/z 307 (M-H)
-
.
[0141] 11. 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(4-Hydroxy-3,5-
dimethoxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 37) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 90%;
1
[0142] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 11.18 (br s, 1 H), 9.31 (br s, 2 H), 6.44 (br
s, 2 H), 3.65 (s, 6 H), 3.61 (s, 1 H), 3.27 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 165.5, 152.4, 148.1,
135.5, 133.9, 106.7, 86.0, 56.5, 29.2; LRMS(ESI) m/z 293 (M-H)
-
.
[0143] 12. 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질)피리미딘-2,4,6(1H,3H,5H)-트리온[5-(3,5-Dibromo-4-hydroxybenzyl)pyrimidine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione](화합물 38) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 44.8%;
1
H NMR (500 MHz, CD3OD) d 7.35 (s, 2 H), 3.48 (s, 2 H);
13
[0144] C NMR (100 MHz,
CD3OD) d 171.7, 150.8, 149.8, 137.9, 131.7, 110.8, 87.7, 26.8.
[0145] <실시예 4> 화합물 39 내지 52 합성
[0146] 하기 표 4는 5-(치환된 벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 유사체 [5-(substituted benzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione analog] 화합물 39-52의 치환 패턴을 설명하기 위한 것이다.
[0147] <화학식 7>
[0148]
표 4
[0149] 화합물
R
1
R
2
R
3
R
4
39 H H OH H
40 H OH OH H
41 OH H OH H
42 H OMe OH H
43 H OEt OH H
44 H OH OMe H
45 H H OMe H
46 H OMe OMe H
47 OMe H OMe H
48 OH H H H
49 H OMe OMe OMe
50 H OMe OH OMe
51 H Br OH H
52 H Br OH Br
5-(치환된 벤질리덴)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온 (화합물 13 ~ [0150] 26에 해당, 30 mg)이 에탄올(5 mL)에 현탁되어 있는 0 ℃ 현탁 용액 속으로 소듐 보로하이드라이드 (NaBH4,3 당량)를 천천히 부가하고 그혼합용액을 실온에서 10분 - 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 휘발시키고 물을 부가한 후 1N-염산(HCl)으로 pH를 7로 맞췄다. 물을 감압 하에서 휘발시킨 다음, 에테르/물 (10 ~ 20 : 1) 또는 에탄올/물 (10:1,화합물 41, 46 및 47의 경우)을 부가하고 생성된 고체를 여과하고 에테르/물 (10 ~ 20 : 1) 또는 에탄올/물(10:1, 화합물 41, 46 및 47의 경우)로 세척하여 목적 생성물을 고체로 얻었다.
[0151] 1. 5-(4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 39) 합성
반응시간, 10 분; 수율, 72.7%;
1
[0152] H NMR (500 MHz, DMSO-d6) d 11.71 (br s, 2 H), 9.03 (br s, 1 H), 6.94 (d,
2 H, J = 7.5 Hz), 6.59 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 3.44 (s, 1 H), 3.43 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d
173.3, 161.6, 155.8, 131.9, 129.6, 115.4, 94.8, 26.9.
[0153] 2. 5-(3,4-디하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,4-Dihydroxybenzyl)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 40) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 92.6%;
1
[0154] H NMR (400 MHz, D2O) d 6.60 (dd, 1 H, J = 2.4, 8.0 Hz), 6.60 (d, 1 H, J
= 2.4 Hz), 6.49 (d, 1 H, J = 8.4 Hz), 3.29 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 171.6, 165.1, 143.8,
141.8, 134.5, 120.1, 116.2, 115.8, 95.0, 26.9.
[0155] 3. 5-(2,4-디하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(2,4-Dihydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 41) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 87.8%;1
[0156] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.98 (d, 1 H, J = 9.0 Hz), 6.30-6.28 (m, 2 H),
3.34 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 171.7, 165.2, 155.1, 154.8, 131.0, 120.4, 107.8, 103.8, 95.0,
22.4.
[0157] 4. 5-(4-하이드록시-3-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 42) 합성반응시간, 2 시간; 수율, 36.8%;
1
[0158] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.76 (s, 1 H), 6.66 (dd, 1 H, J = 8.0 Hz), 6.59
(d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.68 (s, 3 H), 3.38 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 171.7, 165.2, 147.3,
142.7, 134.4, 120.5, 115.5, 112.4, 94.9, 56.0, 27.2.
[0159] 5. 5-(3-에톡시-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Ethoxy-4-hydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 43) 합성반응시간, 2 시간; 수율, 93.7%;
1
H NMR (500 MHz, D2O) d 6.77 (s, 1 H), 6.68 (d, 1 H, [0160] J = 8.0 Hz), 6.62
(d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.95 (q, 2 H, J = 7.0 Hz), 3.41 (s, 2 H), 1.23 (t, 3 H, J = 7.0 Hz);
13
C NMR (100
MHz, D2O) d 169.5, 163.1, 144.1, 140.9, 132.2, 118.5, 113.4, 111.7, 92.8, 63.1, 25.0, 12.0.
[0161] 6. 5-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Hydroxy-4-
methoxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 44) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 96.9%;
1
[0162] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.78 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 6.67 (s, 1 H), 6.65
(d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.68 (s, 3 H), 3.37 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 169.5, 163.1, 143.4,
142.6, 133.0, 117.8, 113.1, 110.8, 92.7, 54.2, 24.8.
[0163] 7. 5-(4-메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Methoxybenzyl)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 45) 합성
반응시간, 30 분; 수율, 78.4%;
1
[0164] H NMR (400 MHz, D2O) d 7.02 (br s, 2 H), 6.71 (br s, 2 H), 3.61 (s, 3
H), 3.38 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 171.6, 165.2, 157.0, 134.3, 129.1, 114.0, 95.0, 55.6, 26.9.
[0165] 8. 5-(3,4-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,4-Dimethoxybenzyl)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 46) 합성
반응시간, 30 분; 수율, 91.4%;
1
[0166] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 10.50 (s, 2 H), 6.81 (s, 1 H), 6.67 (d, 1 H,
J = 8.4 Hz), 6.65 (d, 1 H, J = 8.4 Hz), 3.62 (s, 3 H), 3.61 (s, 3 H), 3.32 (s, 1 H), 3.30 (s, 2 H);
13
C
NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 172.6, 163.7, 148.8, 147.0, 137.4, 120.6, 113.3, 112.3, 90.8, 56.3, 56.0,
28.6.
[0167] 9. 5-(2,4-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(2,4-Dimethoxybenzyl)-2-
thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 47) 합성
반응시간, 30 분; 수율, 86.7%;
1
[0168] H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 10.55 (s, 2 H), 6.71 (d, 1 H, J = 8.0 Hz),
6.38 (s, 1 H), 6.27 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 3.71 (s, 3 H), 3.64 (s, 3 H), 3.38 (s, 1 H), 3.22 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) d 172.7, 164.0, 158.7, 158.4, 128.6, 123.2, 104.3, 98.2, 88.0, 55.8, 55.7,
22.1.
[0169] 10. 5-(2-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(2-Hydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 48) 합성
반응시간, 10 분; 수율, 72.7%;1
[0170] H NMR (400 MHz, D2O) d 7.06 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 6.97 (td, 1 H, J =
1.2, 7.2 Hz), 6.72 (t, 1 H, J = 6.8 Hz), 6.70 (d, 1 H, J = 7.2 Hz), 3.36 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz,
D2O) d 171.8, 165.2, 153.7, 130.2, 128.2, 127.9, 121.0, 116.5, 94.5, 23.0.
[0171] 11. 5-(3,4,5-트리메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,4,5-Trimethoxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 49) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 100%;
1
[0172] H NMR (500 MHz, D2O) d 6.46 (s, 2 H), 3.67 (s, 6 H), 3.56 (s, 3 H), 3.41
(s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, D2O) d 169.7, 163.0, 150.1, 136.6, 132.6, 103.2, 92.2, 58.9, 53.9, 25.9.

[0173] 12. 5-(4-하이드록시-3,5-디메톡시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 50) 합성
반응시간, 2 시간; 수율, 99.4%;
1
H NMR (400 MHz, D2O) d 6.44 (s, 2 H), 3.66 (s, 6 H), 3.37 (s, 2 H);
13
[0174] C
NMR (100 MHz, D2O) d 171.8, 165.2, 147.7, 133.8, 131.8, 105.4, 94.7, 56.4, 27.7.
[0175] 13. 5-(3-브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3-Bromo-4-
hydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 51) 합성
반응시간, 1 시간; 수율, 46.7%;
1
[0176] H NMR (500 MHz, CD3OD) d 7.32 (br d, 1 H, J = 1.5 Hz), 7.04 (dd, 1 H, J
= 2.0, 8.5 Hz), 6.73 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 3.50 (s, 2 H);
13
C NMR (100 MHz, CD3OD) d 173.0, 164.6,
151.5, 135.3, 132.2, 128.3, 115.6, 109.0, 93.2, 26.7.
[0177] 14. 5-(3,5-디브로모-4-하이드록시벤질)-2-티옥소디하이드로피리미딘-4,6(1H,5H)-디온[5-(3,5-Dibromo-4-
hydroxybenzyl)-2-thioxodihydropyrimidine-4,6(1H,5H)-dione](화합물 52) 합성
반응시간, 1 시간; yield, 36.2%;
1
H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7.29 (s, 2 H), 3.52 (s, 2 H);
13
[0178] C NMR (100
MHz, CD3OD) d 173.9, 162.2, 149.1, 134.7, 131.7, 110.8, 93.9, 25.8.
<실시예 5> In vitro ROS ONOO
-
[0179] 소거활성 분석
[0180] 1. 대식세포(Raw264.7) 준비
[0181] Raw264.7 macrophagy 세포(rat prostatic endothelial cell line)는 ATCC(American Type Culture Collection,Manassas, VA, USA)로부터 받았고, 상기 세포는 2mM L-글루타민, 100mg/ml 스트렙토마이신, 2.5mg/L 암포테리신B, 그리고 5% 불활성화된 태아소혈청(FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Nissui,Tokyo, Japan)을 이용하여 배양하였다. 또한 세포는 5% CO2와 95% 공기가 함유된 습한 대기와 같은 조건에서37℃를 유지하였다. 그리고 5% FBS를 첨가하지 않은 것을 무혈청 배지(SFM, serum-free medium)로 사용하였다.
100mm 플라스틱플라스크(Corning Co., New York, USA)에 2일에 한번씩 서브배양하여 세포주를 유지하였다.
2. 시험관내 ROS 측정 및 ONOO
-
[0182] 측정
[0183] 종래 알려진 방법(Chem Res Toxicol. 5: 227-231, 1992)에 따른 DCFDA(2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate) 분석법으로 측정하였다. 즉, 99.9%의 에탄올에 용해한 12.5mM DCFDA와 3차 증류수에 용해한600U/ml 에스테라아제를 -20℃에 스탁용액으로 저장하였으며, 실험 시 10mM DCFDA와 6U/ml 에스테라아제를 혼합하여 조제된 DCFH(2',7'-dichlorodihydrofluorescein) 용액을 22℃에서 20분간 배양한 후 사용 전까지 암소에서 냉동 보관하였다. 지용성의 DCFDA가 에스테라아제 또는 산화적 가수 분해를 받아 비형광성인 DCFH로 탈아세틸화되며, DCFH는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF(2',7'-dichlorofluorescein)가 되므로,excitation 파장 485nm 및 emission 파장 530nm에서 형광광도계(GENios, TECAN)로 측정하였다. 활성산소 생성원으로는 SIN-1(3-morpholinosydnonimine hydrochloride) 50μM을 이용하여 에스터라아제와 반응하여 ROS를 임의적으로 생성한다.
[0184] 그 결과, 도 1과 같이 임의로 발생한 ROS를 양성대조군인 트롤록스(Trolox)만큼 소거하는 효과가 큰 화합물로서화합물 28, 30, 31, 32, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 48, 50, 51을 선별할 수 있었다.
상기 26종의 신규화합물들을 대상으로 ONOO
-
[0185] 소거 및 생성 억제 활성은 쿠이등(Kooy et al., FreeRadic.Biol.Med.16:149-156,1994)의 방법에 따라 ONOO
-
에 의해 매개되는 디하이드로로다민(dihidrorhodamine123; 이하 "DHR"이라 함)의 산화반응을 이용하여 형광 분광분석법으로 측정, 분석하였다. 비형광성(nonfluorescent)DHR 123은 ONOO
-
에 의해 산화되어 형광성(fluorescent)의 로다민(rhodamine)123을 형성하게된다. 이러한 성질을 이용하여 상기 26종의 화합물들을 각각 DHR123 용액에 넣어 반응 시킨 후 ONOO
-
첨가에 따른 형광도의 변화를 측정함으로써 신규화합물들에 의한 ONOO
-
소거 활성을 조사하였으며, ONOO
-
소거 활성을 측정
하기 위한 기질로는 순수한 ONOO
-
(authentic peroxynitrite)를,ONOO
-
생성 억제 효과를 측정하기 위한 기질로는
ONOO
-
를 생성하는 SIN-1(3-morpholinosydnonimine)을 사용하였다. 그 결과, 도 1과 같이 ONOO
-
소거하는 효과가큰 화합물로서 화합물 28, 29, 30, 31, 32, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 48, 50, 51, 52를 선별할 수 있었다.
<실시예 [0186] 6> TLR4 결합 친밀도 측정
[0187] 본 발명에서는 도 1에서 선별된 두 개의 신규화합물이 NF-κB 활성화 경로에 직접적인 영향을 끼치는 TLR4 수용체에 억제효과 및 영향을 끼치는지 확인하기 위해서 도킹 시뮬레이션(docking simulation)을 통해서 친밀도를확인해보았다. 42번과 50번은 TLR4 복합체중 MD2 부분에 직접 결합하는 것을 확인할 수 있었고, 또한 각각의 친밀도를 확인해본 결과 메톡시기(Methoxy)가 하나인 화합물 42번에서 보다 메톡시기(Methoxy)가 두 개인 화합물50번에서 좀 더 친화도가 높은 것으로 보아서 TLR4에 억제효능이 화합물 50번이 좀 더 효과가 좋았다. 즉 이에따른 신호전달경로, 산화스트레스, NF-κB 활성 그리고 염증반응 모두 억제효과가 나타남을 아래 실험으로부터확인할 수 있었다(도 2).
[0188] <실시예 7> 세포 독성 실험
[0189] 이 화합물의 독성test와 적정한 농도 사용을 위하여, EZ-cy Tox kit를 이용하여 세포 생존능 분석(Cellviability Assay)을 측정하였다. 화합물 42 과 50을 각각 1μM~50μM의 농도로 측정하였고, 그 결과 50μM에서각각 약간의 Cell death가 보였다(도 3). 그 결과, 가장 적정 농도인 1,5,10μM의 농도를 실험 농도로 선택하였다.