대황 추출물을 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 및 치료용 조성물

본 발명은 대황 추출물의 알츠하이머성 치매 예방, 치료 또는 개선을 위한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 대황 추출물은 알츠하아미성 치매 질환의 원인으로 여겨지는 베타-아밀로이드 펩타이드의 생성과정에 관여하는 효소 중 하나인 베타-시크리타아제(β-site Amyloid precursor protein Cleaving Enzyme, BACE)의 활성을 특이적으로 저해하여, 알츠하이머성 치매 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

청구범위
청구항 1
하기 화학식 1로 표시되는 푸코푸로에콜-B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 치료용의약 조성물.
[화학식 1]
청구항 2
제 1 항에 있어서,푸코푸로에콜-B는 의약 조성물 100 중량부 대비 0.0001 내지 10 중량부로 포함되는 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 3
제 1 항에 있어서,약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 4
제 1 항에 있어서,산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피투여제 또는 좌제의 형태인 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 5

하기 화학식 1로 표시되는 푸코푸로에콜-B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 개선용식품 조성물.
[화학식 1]
청구항 6
제 5 항에 있어서,푸코푸로에콜-B는 식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 내지 50 중량부로 포함되는 알츠하이머성 치매 질환 예방또는 개선용 식품 조성물.
청구항 7
제 5 항에 있어서,식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 추가로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 또는 개선용 식품조성물.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 대황(Eisenia bicyclis) 추출물의 알츠하이머성 치매 질환 예방, [0001] 치료 또는 개선을 위한 용도에 관한것이다.
배 경 기 술
[0002] 뇌(brain)와 척수 (spinal cord)로 구성된 중추신경계는 생명현상을 운영하는 중심센터로서 감각과 (불)수의적인 운동에서부터 사고, 기억, 감정, 언어 등에 이르기까지 인체의 모든 기능을 총괄하는 아주 필수적인 기관이다. 따라서 뇌졸중, 외상 등으로 야기된 급행적인 신경세포의 사멸이나, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 파킨슨 질환 등과 같은 중추신경계 퇴행성 질환을 유발시키는 서행적인 신경세포의 사멸등과 같은 모든 경우에서는 곧 바로 신경회로망의 비가역적인 기능장애를 초래하게 되며 결국에는 해당 인체 기능의 영구적인 손실을 초래하게 된다. 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매는 인간 평균수명의 연장과 의료복지시설의 현대화와 맞물려 비례적으로 증가하는 특성을 가지고 있다. 보건사회연구원 통계조사에 다르면 우리나라의 노인인구가2000년에 7%를 넘어 고령사회에 진입한 이래 2003년 397만 명으로 노인인구의 비율이 8.3%에 이르렀고 2019년에는 14.4%에 이르러 완전고령사회에 진입할 것으로 예견된다. 65세 이상 노인인구 중 한 가지 이상 만성질환을가지고 있는 노인은 에 이르며 특히 65세 이상 노인의 치매 유병율도 8.2%로 추정된다. 서구사회에서는 65세 이상인구의 약 10%, 80세 이상인구의 약 40 ~ 50%에서 알츠하이머병이 발생하고 있으며, 이미 미국에서는 이 질환환자가 500만 명 이상으로 이로 인한 의료비 지출이 연간 1000억 달러로 추정되고 있다. 또한 우리나라에서는약 20만 명 이상이 치매 환자인 것으로 나타났다. 미국의 경우 2030년까지 현재의 2배 규모로 증가하고, 2050년까지는 350% 이상 늘어난 1,400만 명에 달할 것으로 추정되고 있다.
[0003] 인지 기능 장애로 시작되는 알츠하이머병은 인간 본성이 파괴되며 장기간에 걸쳐 진행되는 퇴행성 질환이기 때문에 환자를 수용하는 수동적인 방법으로는 도저히 사회 경제적 부담을 감당할 수가 없으므로 예방제 및 원인치료제를 개발하는 적극적인 시도를 해야 한다. 그러나 현재까지는 알츠하이머 질환의 근본적인 발병원인을 치할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용 가능한 것으로는 아세틸콜린 에스테라제 저해제인 화이자사의 아리셉트(Aricept), 노바티스사의 엑셀론(Exelon), 그리고 얀센사의 레미닐(Reminyl)과최근에 미국 FDA로부터 허가를 받은 NMDA수용체의 길항제 기전의 룬드벡사의 에빅사(Ebixa; Memantine)가 있다.
그러나 아세틸콜린 에스테라제 저해제의 경우는 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐 알츠하이머 질환의 근본적인발병 원인을 치료하지는 못한다. 또한, 단지 일부 환자의 경우 (약 40-50%)에서 일시적인 증세 완화 효과를 보이며, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 근본적인 치료제라 하기 어렵다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우 간 독성, 구토, 식욕감퇴를 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 등의 문제점을 안고 있다. 따라서 질환의 진행 과정을 막아 줄 수 있는 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다. 이를위해서 많은 다국적 제약회사들이 이 분야에 대한 연구 개발에 막대한 투자를 하고 있으며 특히 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인으로 추정되고 있는 40여개의 아미노산으로 구성된 베타-아밀로이드의 생성량을 감소시키는 베타 또는 감마 시크리테아제 저해제의 개발이 그 주종을 이루고 있다. 국내의 경우 알츠하이머 질환에 대한 기초 연구는 어느 정도 이루어지고 있으나 치매 치료제 개발 그 자체의 경우는 거의 전무한 실정이라고 사료다. 감마 시크리테아제(secretase) 저해제의 경우 동물 실험 모델에서뿐만 아니라 최근의 임상 실험 결과에서도 상당한 독성을 수반함으로써 그 전망이 불투명하다. 비교적 연구 개발 기간은 상대적으로 짧으나 베타-시크리테아제의 경우에 유전자 결핍 형질 전환 동물모델의 결과에서도 나타난 것처럼 좀 더 안전하고도 효율적인 치매 치료제 개발을 위한 타겟으로써 유망하다고 할 수 있다. 또한 베타-아밀로이드의 응집에 관여하는 인자를 타겟으로 하는 것도 비교적 안전하게 효과를 보는 것으로 생각되고 있다. 최근 베타-아밀로이드를 타겟으로 하는신약 개발에서 미국의 앤소닉스사에서 펜세린(Phenserine)이라는 약물에 대해 임상 3상이 진행되었으나 약효가대조군에 비해 월등하지 않아 진행이 더 이상 되지 않았으나 이 약물은 이중 기능을 가지고 있어 콜린에스테라제(cholineesterase) 저해 효과도 함께 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다(Greig et al., J. Med. Chem. 44,pp.4062-4071, 2001; MedicalNewsToday 2004년 9월 4일 기사, www.medicalnewstoday.com; 미국 알츠하이머 협회 홈페이지, www.alzforum.org/drg/drc).
가능성이 있는 다른 방법으로는 베타-아밀로이드를 이용한 백신(Vaccine)의 개발이다. [0004] 엘란(Elan)회사를 중심으로 진행된 일련의 연구 및 임상의 결과로 베타-아밀로이드 펩타이드를 백신으로 이용 가능하다는 결과가 보고되었으나 임상 2상에서 소수의 환자에서 뇌염증 반응이 일어나 중단된 상태이다. 현재 다양한 베타-아밀로이드 구조를 이용한 백신 개발이 진행되고 있다. 동물실험의 결과로 베타-아밀로이드 백신은 뇌 속에 형성된 노인반의수를 줄이고 모델동물의 인지능을 향상시키는 것으로 알려졌다. 또한 뇌세포의 활성을 증진하고 손상을 입은 뇌신경세포의 활성을 증진시켜 인지 기능을 향상시킴으로 알츠하이머를 완화할 수도 있다.
[0005] 따라서, 새로운 기능의 알츠하이머병의 치료제 개발을 위해서는 아세틸콜린 에스테라제 저해 효능 약물에 베타-아밀로이드 응집, 독성 저해 효과 및 항산화 효과 등에서의 활성이 확인된다면 매우 우수한 치료약물이 될 수있을 것으로 판단된다. 이러한 전략은 Datamonitor 등이 제안한 질병의 치료목적과 효능의 극대화를 이룰 수 있을 것으로 생각된다. 치료제 개발은 원인을 제거하는 방법과 기존의 약물과 같은 증상완화제를 동시에 개발하는것을 알 수 있다(Nature Review Drug Discovery (2007) 6, p.341).
[0006] 한편, 대황(Rhei Rhizoma)은 마디풀과에 속한 다년생 초본류인 장군풀 및 동속 근연식물의 근 및 근경으로서 약15종의 식물이 존재하는데, 이중에서도 한국에서는 장군풀(Rheum coreanum Nakail), 종대황(Pheum undulatumLinne) 등의 건조한 근 및 근경을 기원식물로 하고 있으며, 중국에서는 장엽대황(Rheum palmatum Linne), 당고특대황(Pheum tanguticum Maxim) 및 약용대황(Rheum offcinale Baill) 등의 건조한 근 및 근경을 그 기원으로삼고 있다. 대황의 성분에 대한 연구는 최근까지 계속되고 있으며, 센노사이드 A(sennoside A)에 의한사하작용, 소화기점막손상방지, 알로에-에모딘(aloe-emodin) 및 레인(rhein)의 항균작용 등이 보고되어 있다(中本草編纂委: 中華本草,上海科學技術出版社, 제2권. p710,715~716,1996). 또한 대황은 임상적으로 소화불량,변비, 급성염증, 전염병, 기생충병, 출혈, 혈소판 감소증, 화상 및 피부병의 치료에 응용된다.
발명의 내용
해결하려는 과제
[0007] 본 발명에서는 베타-시크리타아제 억제할 수 있는, 즉, 알츠하이머성 치매를 예방 또는 치료할 수 있는 물질을개발하여, 이를 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제의 해결 수단
본 발명에서는 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 [0008] 예방 및 치료용 의약 조성물을 제공한다.
[0009] 또한, 본 발명에서는 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[0010] 또한, 본 발명에서는 1) 대황을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 물 및 에탄올의 혼합 용매로 분획하여 에탄올/물 분획을 얻는 단계; 및
[0011] 2) 상기 단계 1)로부터 얻은 에탄올/물 분획에 대해 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획을 얻는 단계를 포함하는 대황 추출물 분획의 제조 방법을 제공한다.
[0012] 또한, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 푸코푸로에콜-B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 및 치료용 의약 조성물을 제공한다.
[0013] [화학식 1]
[0014]
[0015] 또한, 본 발명에서는 전술한 푸코푸로에콜-B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 예방 및 개선용식품 조성물을 제공한다.
발명의 효과
[0016] 도 1은 대황 추출물의 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
[0017] 도 2는 실시예 1에서 분리한 활성 획분인 에틸아세테이트층(에틸아세테이트 획분)의 분리 정제 과정을 나타내는모식도이다.
[0018] 도 3은 라인위버벌크법을 이용하여 효소-기질간의 저해패턴을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 3에서 분리된 최종 활성 획분인 Fr. B1-F1B에 대해13C-NMR 스펙트럼 및1
[0019] H-NMR 스펙트럼을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
[0020] 도 5는 푸코푸로에콜-B의 (A) SH-SY5Y 세포 및 (B) BV-2 세포에서의 세포독성을 나타내는 그래프이다.
[0021] 도 6은 푸코푸로에콜-B의 베타-아밀로이드로 독성을 유도한 (A) SH-SY5Y 세포 및 (B) BV-2 세포에서의 세포 보호효과를 나타내는 그래프이다.
[0022] 도 7은 BV-2에서 푸코푸로에콜-B의 ROS 저해효과를 나타내는 그래프이다.
[0023] 도 8는 신경아종세포에서 푸코푸로에콜-B가 아밀로이드 전구 단백질 작용에 미치는 영향을 나타내는그래프이다.
[0024] 도 9는 베타-아밀로이드로 염증반응을 유도한 신경아종세포에서 푸코푸로에콜-B의 항염증 효과를 나타내는 그래프이다.
[0025] 도 10은 베타-아밀로이드로 독성을 유도한 신경아종세포에서 푸코푸로에콜-B로 인한 힘옥시게나제(HO-1) 발현및 세포사멸억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도면의 간단한 설명
[0026] 본 발명의 대황 추출물은 알츠하아미성 치매 질환의 원인으로 여겨지는 베타-아밀로이드 펩타이드의 생성과정에관여하는 효소 중 하나인 베타-시크리타아제(β-site Amyloid precursor protein Cleaving Enzyme, BACE)의 활성을 특이적으로 저해하여, 베타-아밀로이드 생성억제, 베타-아밀로이드 침착저해 및 베타-아밀로이드로 인한신경독성을 제거하여 알츠하이머성 치매 질환을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
더욱이, 대황 추출물에서 분리된 푸코푸로에콜-B는 알츠하아미성 치매 질환의 예방, 치료 또는 개선에 매우 우수한 효과를 가진다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명에서는 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 질환 [0027] 예방 또는 치료용 의약 조성물을제공한다.
[0028] 본 발명의 대황 추출물의 제조 시에는 건조 또는 미건조시킨 대황 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출의 효율성을 위해 대황은 잘게 부수어 사용할 수 있다. 또한, 효과적인 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 대황 추출물을 얻기 위해, 대황의 분쇄 전에 약 100℃의 높은 온도에서 약 5분간 블랜칭(blanching)을 수행하여세포 내 효소를 불활성화시키는 과정을 거칠 수 있다.
[0029] 본 발명에서 대황 추출물의 제조를 위해서는 대황의 3 내지 10 배의 추출 용매를 사용하여 통상적인 추출 방법에 따라 추출할 수 있다.
[0030] 추출 용매로는 천연물 추출에서 널리 이용되고 있는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이용할 수 있다.
상기 유기 용매로는 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름 및 에탈아세테이트 등이 포함된다. 이러한 유기 용매는물과 혼합하여 사용할 수 있으나, 활성 성분의 용이한 용출을 위해서 물과 혼합하지 않고 사용할 수도 있다. 한구체예에서, 상기 대황 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
[0031] 상기 대황 추출물은 1차 추출에서 사용된 유기 용매와는 극성이 다른 유기 용매를 사용하여 추가로 분획할 수있다. 이 경우, 상기 대황 추출물은 대황을 유기용매로 추출하고, 그 잔사를 극성이 다른 유기용매를 이용하여분획함으로써 수득한 대황 추출물 분획일 수 있다.
[0032] 또한, 상기 대황 추출물 또는 대황 추출물 분획에 대해 LH-세파덱스, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gelcolumn chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써 추가로정제된 분획을 얻을 수도 있다. 본 발명에 있어서, '대황 추출물'은 이와 같이 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 포함한다.
[0033] 본 발명의 한 구체예에서, 상기 대황 추출물은 대황을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 물 및 에탄올의 혼합 용매로 분획하여 얻은 에탄올/물 분획일 수 있다.
[0034] 또한, 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 대황 추출물은 대황을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 물 및 에탄올의 혼합 용매로 분획하여 얻은 에탄올/물 분획에 대해 에틸아세테이트로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획일 수 있다.
[0035] 상기 수득한 대황 추출물 분획에 대해 LH-세파덱스, 컬럼크로마토그래피를 반복적으로 수행하거나 TLC(thinlayer chromatography) 및 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하여 추가로 정제된 대황 추출물 분획을 얻을 수도 있다.
[0036] 하기 실시예에서는 이러한 추가적인 정제과정을 통해 대황 추출물로부터 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료 활성을 나타내는 활성성분이 풀로로탄닌 화합물, 구체적으로 플로로엑콜 화합물 또는 하기 화학식 1로 표시되는푸코푸로에콜-B 임을 확인하였다.
[0037] [화학식 1]
[0038]
[0039] 따라서, 본 발명은 푸코푸로에콜-B를 함유하는 대황 추출물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
[0040] 본 발명은 또한
[0041] 1) 대황을 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 물 및 에탄올의 혼합 용매로 분획하여 에탄올/물 분획을 얻는단계; 및
[0042] 2) 상기 단계 1)로부터 얻은 에탄올/물 분획에 대해 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획을 얻는 단계를 포함하는 대황 추출물 분획의 제조 방법을 제공한다.
[0043] 본 발명은 또한 푸코푸로에콜-B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 의약 조성물을제공한다. 비록 푸코푸로에콜-B가 본 발명에 따른 대황 추출물로부터 분리된 것이긴 하나, 이는 화학적으로 합성되거나 상업적으로 입수할 수 있으며, 또한 다른 식물로부터 분리해 낼 수 있을 것이다.
[0044] 본 발명의 하기 실시예에서는, 대황을 100% 에탄올로 추출하여 얻은 잔사를, 헥산:물:에탄올 및 에틸아세테이트의 순으로 분획하여 대황 추출물 분획을 제조하였다. 또한, 상기 대황 추출물 분획 중 에틸아세테이트 분획을추가로 분획하고 정제하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 본 발명의 대황 추출물, 대황 추출물 분획 및 푸코푸로에콜-B는 우수한 베타-시크리테아제 저해 효과를 나타낸다.
[0045] 따라서 본 발명의 대황 추출물, 대황 추출물 분획 및 푸코푸로에콜-B는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료의 유효 성분으로 포함될 수 있다.
[0046] 본 발명의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 조성물은, 특히 베타-시크리테아제의 활성을 저해하며, 베타-시크리테아제의 활성에 의해 야기되는 질환인, 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
[0047] 상기 조성물은 본 발명의 유효성분뿐만 아니라 기존에 공지된 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다.
[0048] 본 발명의 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물은 상기 유효 성분 이외에약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제,붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
[0049] 상기 의약 조성물 내의 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태, 투여 방법 및 제제의 형태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 100 중량부에 대하여,0.0001 내지 10 중량부 또는 0.001 내지 1 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
[0050] 상기 의약 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
[0051] 상기 의약 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제,점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다.
적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 포함하는 알츠하이머성 [0052] 치매 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
[0053] 본 발명에서 용어 ‘식품 조성물’이란, 상기 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
[0054] 본 발명에서 알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물은 전술한 의약 조성물과 같이, 베타-시크리테아제의 활성에 의해 야기되는 알츠하이머성 치매의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다.
[0055] 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 의약 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나,각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 육류, 소세지, 빵,초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프,음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
[0056] 상기 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 식품첨가물로 사용하는 경우, 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 통상 0.01 내지 50 중량부 또는 0.1 내지 20 중량부의 범위이다. 또한과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량부, 또는 0.5 내지 80 중량부의 범위에서첨가하면 된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위이상의 양으로도 사용될 수 있다.
[0057] 상기 식품 조성물은, 추가로 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린과같은 다당류 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
[0058] 또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 투여하는 것을 포함하는 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
[0059] 여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을말한다.
[0060] 여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~1000㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 대황 추출물 또는 푸코푸로에콜-B를 유효 [0061] 성분으로 포함하는 조성물은 경구,직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로투여할 수 있다.
[0062] 본 발명은 이들의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.
[0063] [실시예]
[0064] 실시예 1: 대황 추출물의 제조
[0065] 울릉도에서 채집한 대황(Eiseniabycylis)은 깨끗이 수세하여 40℃에서 완전 건조한 후 마쇄하여 추출원료로 사용하였다.
[0066] 대황 분말은 도1에 나타낸 방법에 따라 추출을 실시하였다. 구체적으로, 분말화된 대황 1kg에 80% 에탄올 3L를가한 후, 암 조건에서 교반하여 24간마다 2회 추출한 다음 여과 후 농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 이때, 대황의 에탄올 추출물의 추출 수율은 14.0%였다.
[0067] 농축된 에탄올 추출물은 헥산:물:에탄올(6:3:3) 용액 50㎖에 용해시킨 후, 도 1에 도시한 것과 같이 액/액 추출법을 통해 추출하였다. 먼저 에탄올 추출물은 헥산층을 분리하였으며, 헥산층을 추출 후 남은 에탄올/물 층에헥산 50㎖를 가하여 동일한 방법으로 재 분리를 실시하였다. 헥산층 분리 후 남은 에탄올/물 층은 100ml 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트층을 분리하였다. 분획된 헥산층, 에틸아세테이트층 및 에탄올/물층은 감압농축을 실시하여 일정량의 무게로 정평한 후에 베타-시크리테아제 저해활성을 측정하였다.
[0068] 대황 에탄올 추출물의 추출수율은 14%이었으며, 헥산 및 에틸아세테이트 획분의 추출 수율은 각각 4.8% 및 3.1%였다.
[0069] 실시예 2: 베타-시크리테아제 저해활성 측정
[0070] 전술한 실시예 1에서 제조된 대황 추출물들의 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 알츠하이머 질병 진행의 주요 기작에 관여하는 베타-시크리테아제의 억제 활성 정도를 베타-시크리테아제 inhibitory activity assay를 통하여 분석하였으며, 각 가수분해물 중 베타-시크리테아제 저해 활성이높은 물질이 다량 함유되어 있는 추출물 획분을 선정하였다.
[0071] 베타-시크리테아제 억제 활성은 베타-시크리테아제 분석 키트(베타-시크리테아제 assay kit)에서 제시한 방법을변형하여 측정하였다. 구체적으로, 70 ㎕ buffer(50 mM sodium acetate, pH 4.5), 10 ㎕ 베타-시크리테아제(1.0 Unit/㎖), 10 ㎕ substrate(10 mM MCA-[ASN670, LEU671]-AMYLOID BETA/A4 PRECURSOR PROTEIN 77, 50 mMsodium acetate buffer, pH 4.5)를 10 ㎕의 시료액과 혼합한 후, 25℃에서 20분간 암 조건에서 반응시켰다. 형광 reader(Bio-Rad)는 excitation 360 ㎚로 하고, emission 405 ㎚로 하여 측정하였다. 베타-시크리테아제의저해율은 하기 식 1을 사용하여 계산하였다.
[0072] <식 1>
[0073] Inhibition(%) = [1-{(S-S0)/(C-C0)}]×100
[0074] C:　시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme+buffer+substrate)의 반응 시작 후 20분 후의 형광도값
[0075] C0: 시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme+buffer+substrate)의 반응 직전(zero time)의 형광도값
[0076] S:시료액이 첨가된 실험군(Enzyme+sample+substrate)의 반응 20분 후의 형광도값
S0: 시료액이 첨가된 실험군(Enzyme+sample+substrate)의 반응 [0077] 직전(zero time)의 형광도값
[0078] 대황 추출물의 베타-시크리테아제 저해활성은 IC50값으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 도시하였다.표 1
[0079] IC50 value (mg/ml)
에탄올 층 0.70
헥산 층 1.02
에틸아세테이트층(EtOAcfr.) 0.24
물층 2.12
[0080] 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 에탄올 추출물 및 추출 획분의 베타-시크리테아제 저해활성은 IC50값으로 각각0.70 ㎎/㎖, 1.02 mg/ml, 0.24 mg/ml 및 2.12 mg/ml로 나타났으며, 에틸아세테이트 획분의 저해활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
[0081] 이하, 에칠아세테이트 획분을 크로마토그래피법을 이용하여 분리정제하였다.
[0082] 실시예 3: LH-세파덱스 및 Thin layer chromatography법을 이용한 베타-시크리테아제 저해 물질 분리정제[0083] 실시예 1에서 분리한 활성 획분인 에틸아세테이트층(에틸아세테이트 획분)의 분리정제는 도 2의 모식도와 같이수행하였으며, 분리된 활성 획분의 베타-시크리테아제 저해활성 결과는 표 3에 기재하였다.
[0084] 먼저, 에틸아세테이트층(에틸아세테이트 획분, EtOAcfr.)을 LH-세파덱스에서 분리하였다. 분리조건은 하기 표 2와 같이 수행하였다.
표 2
[0085] 조건 내용
컬럼구격 직경 1.5cm, 높이 50cm
용매 메탄올
유속 2.0 mg/ml
획분 수집량 8.0ml
[0086] 상기 표 2에 나타낸 조건에 따라 분리를 실시한 결과, 5개의 획분(Fr.A~Fr.F)으로 분리되었으며, 분리된 획분은일정량으로 농축을 실시하고, 각 획분의 베타-시크리테아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과 분리된 5개의 획분 중에서 Fr.B 획분의 활성이 가장 우수하였다(표 3 참조).
[0087] 활성이 우수한 Fr.B 획분은 고체상 추출 컬럼(Solid phase extraction, SPE)을 이용하여 분리정제를실시하였다. SPE는 C18 레진이 충진된 컬럼으로 역상 흡착법을 통하여 물질을 분리 정제하였다. SPE 컬럼을 통해 4개의 획분(Fr. B1 ~ B4)을 분리하였으며, 각 획분의 베타-시크리테아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과분리된 획분 중 Fr. B1 획분의 베타-시크리테아제 저해 활성이 가장 우수하였다(표 3 참조).
[0088] 활성이 가장 우수한 Fr. B1 획분은 얇은막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 분리정제를 실시하였다. TLC 분리는 유기용매 추출물들을 비극성 및 극성물질로 분획할 수 있으며, 헥산, 에틸아세테이트 및 아세톤을 7:3:0.1 비율로 제조한 용리액을 이용하여 총 8개의 획분을 분리하였다. 각 획분의 베타-시크리테아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, 8개의 획분 중 Fr.B1-F1의 베타-시크리테아제 저해활성이 가장우수했다(표 3 참조).
[0089] 상기 Fr.B1-F1 획분은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromography, HPLC)을 이용하여분리정제를 실시하였다. 상기 HPLC를 통하여 3개의 획분(Fr. B1-F1A ~ B1-F1C)을 분리하였으며, 각 획분의 베타-시크리테아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, Fr. B1-F1B의 베타-시크리테아제 저해활성이 가장우수했으며, 최종적으로 Fr. B1-F1B 획분의 활성 물질을 분리하였다.
[0090] 분리된 최종 물질의 베타-시크리테아제 저해활성은 IC50값으로 나타내었을 때, 18.15 μg/ml로, 에칠아세테이트획분의 활성이 비하여 13.2배 증가한 것을 확인할 수 있다.
표 3
[0091] Purification step IC50 value (μg/ml)
Purification fold
*
EtOAcfr. 240.01±0.08 1.00
Sephadex LH-20 (Fr. B) 160.13±6.45 1.47
SPE column (Fr. B1) 91.53±7.52 2.62
TLC (Fr. B1-F1) 38.24±5.16 6.27
HPLC (Fr. B1-F1B) 18.15±4.25 13.22
*
Relative value of reciprocal of β?ecretase inhibitory activity by IC50 value[0092] 또한, 도 3은 라인위버벌크법을 이용하여 효소-기질간의 저해패턴을 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 분리된 최종물질은 농도별로 처리한 것의 그래프가 X선에 교차되므로 베타-시크리테아제 저해활성에 대한 비-경쟁적 저해특성을 나타내었으며, Ki값은 10.1 μM로 나타났다. 분리된 효소-기질간의 “비경쟁적 저해”는 저해제가 효소또는 단백질의 활성부위에 또는 그와 인접하거나 떨어진 위치에 결합할 수 있으며, 효소와 관련하여 Km값에는영향을 미치지 않으나, Vmax를 감소시킨다.
[0093] 실시예 4: 대황으로부터 분리된 활성성분의 동정실시예 3에서 분리된 최종 활성 획분인 Fr. B1-F1B에 대해13
C-NMR 스펙트럼 및1[0094] H-NMR 스펙트럼을 수행하여, 그결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에서 (A)는13C-NMR 스펙트럼을, (B)는1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
[0095] 결과, 활성획분은 푸코푸로엑콜-B(C24H14O11)인 것으로 확인되었다.1
[0096] H-NMR(300MHz, DMSO) δ: 11.58(1H, s, 14-OH), 10.05 (1H, S, 4-OH), 9.88 (1H, s, 10-OH), 9.45(1H, s, 2-
OH), 9.11 (2H, s, 3’5’-OH), 8.22(1H, s, 8-OH), 6.71 (1H, s, H-13), 6.48 (1H, d, J=1.1 Hz, H-11),
6.34(1H, s, H-3), 6.38 (1H, d, J=1.5 Hz, H-9), 5.86 (1H, s, H-4’), 5.83 (2H, d, J=1.5 Hz, H-2, 6’).13
[0097] C-NMR (300 MHz, DMSO) δ: 160.22 (C-1’), 158.81 (C-3, 5’), 158.23 (C-11a), 157.62 (C-10), 150.46
(C-12a), 150.33 (C-8), 146.46 (C-2), 144.33 (C-14), 141.56 (C-4), 136.82 (C-15a), 133.63 (C-5a),
123.58 (C-14a), 122.4 (C-4a), 122.04 (C-1), 103.13 (C-6), 102.48 (C-7), 98.43 (C-3), 98.23 (C-9), 96.6(C-4’), 96.14 (C-13), 93.2, (C-2’, 6’) 90.68(C-11).
[0098] 실시예 5: 푸코푸로에콜-B의 신경아종세포 보호효과
[0099] 대황에서 분리된 푸코푸로에콜-B의 신경아종세포인 SH-SY5Y 및 BV-2세포에서의 세포독성을 측정하였다.
[0100] 신경아종세포인 SH-SY5Y의 세포배양은 L-Glutamine, 15 mM HEPES이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle mediumnutrient mix F12 medium(GIBCO, Carlsbad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum(GIBCO, Carlsbad, CA, USA)및 100 U/mL penicillin?streptomycin를 첨가하여 37℃에서 5 % CO2 조건에서 배양하였다. 신경아종세포인 BV-2의 세포 배양은 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM; Gibco, USA)에 5% fetal bovine serum(Hyclone,USA) 및 100 U/mL penicillin?streptomycin를 첨가하여 37℃에서 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양시세포수는1x104 cell/well로 조절하여 96-well plate에 분주하고 24시간 배양하였다.
[0101] 배양된 신경아종세포에 푸코푸로에콜-B를 농도별(15, 25, 50, 100 및 200 μg/ml)로 처리하고, 24시간 배양을실시한 후, 5 mg/ml의 MTT 용액을 15 μl/well로 세포에 처리하고 3시간 동안 배양 후 DMSO를 150 μl/well로넣어 세포를 solublization 시켰다. Microplate reader(TECAN)기기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
[0102] 세포독성(Cell viability)은 하기 식에 의해 계산하였으며, 도 5에 나타내었다.
[0103] <식 1>
[0104] Cell viability(%)=Ab570(시료비처리군)-Ab(시료군)/Ab(시료비처리군) X 100
[0105] 도 5는 푸코푸로에콜-B의 (A) SH-SY5Y 세포 및 (B) BV-2 세포에서의 세포독성을 나타내는 그래프로, 푸코푸로에콜-B 200 μg/ml 농도까지 세포독성은 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다.
[0106] 또한, 베타-아밀로이드로 독성을 유발한 신경아종세포에서 푸코푸로엑콜-B의 신경아종세포 보호효과를 측정하였다.
베타-아밀로이드 펩타이드를 250 uM 농도로 100% DMSO에 완전히 녹인 후, PBS로 [0107] 1:10으로 희석하여 25 μM농도로 제조하였다. 4일간 실온에서 응집 반응이 일어나게 유도한 후, 1.5 ml 튜브(tube)에 나누어 냉동 보관하여사용하였다. 100 mm dish에 약 80% 정도로 confluent하게 배양한 신경아종세포인 SH-SY5Y 및 BV-2 세포를trypsin-EDTA용액(1X) 500 μl으로 처리하여 dish에서 떨어뜨렸다. 배양배지 5 ml을 넣고 부유시킨 후hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 96 well plate에 세포 부유액을 1x104cell/well로 넣고, 37℃,5% CO2 세포 배양기에서 4시간 이상 배양하였다. 세포가 plate에 붙은 걸 확인 후 serum이 없는 배지로 100 μl/well로 갈아주고 1시간 배양하였다. 푸코푸로에콜-B를 50% DMSO에 농도별로 희석한 후, 5 μl/well씩 넣고 1시간 배양하였다. 응집시킨 베타-아밀로이드를 1 μM 농도로 세포에 처리한 후, 18-20시간 동안 배양하였다. 5mg/ml의 MTT 용액을 15 μl/well의 세포에 처리하고 3시간 동안 배양 후 DMSO를 150 μl/well로 넣어 세포를solublization 시켰다. Microplate reader(TECAN)기기를 이용하여 흡광도를 570nm에서 측정하였다.
[0108] 세포독성은 전술한 식 1에 의해 계산하였으며, 도 6에 나타내었다.
[0109] 도 6은 푸코푸로에콜-B의 베타-아밀로이드로 독성을 유도한 (A) SH-SY5Y 세포 및 (B) BV-2 세포에서의 세포 보호효과를 나타내는 그래프로, 베타-아밀로이드에 대한 세포독성으로부터 푸코푸로에콜-B의 처리에 따라 농도 의존적으로 보호효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
[0110] 실시예 6: DCFH-DA를 이용한 세포내 ROS 저해 효과
[0111] ROS의 세포내 형성을, 기질로서 산화 민감성 염료 DCFH-DA를 사용하여 Engelmann 등의 문헌(Engelmann, J.,Volk, J., Leyhausen, G., &Geurtsen, W. (2005). ROS formation and glutathione levels in human oralfibroblasts exposed to TEGDMA and camphorquinone. Journal of Biomedical Materials Research Part B:Applied Biomaterials, 75B, 272-276)에 기재된 방법에 따라 평가하였다.
[0112] 신경아종세포인 BV-2 세포를 블랙 미량역가(black microtiter) 96-well 플레이트에 배양한 후, HBSS(hanksbalanced salt solution)에 용해된 20 μM DCFH-DA로 표지하고 암실에서 20분간 유지시켰다. 세포 내로 자유롭 투과되는 비-형광 DCFH-DA 염료는 세포네 에스테-8-라아제에 의해 2’,7’-디클로로디하이드로플루오레세인(DCFH)으로 가수분해되어 세포 내부에 포획된다. 그 다음 세포에 다른 농도의 시료들을 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후에 500 μM H2O2 (HBSS에 용해)를 첨가하였다. 다양한 ROS의 존재 시에DCFH의 산화에 의한 형광 DCF의 형성을 485 nm의 여기 파장 및 528 nm의 방출파장에서 매 30분 마다판독하였다. 처리의 투여량-의존 및 시간-의존 효과를 플롯팅한 후 처리되지 않은 시료의 대조군의 형광 밀도와비교하여 도 7에 나타내었다.
[0113] 본 발명에서 도 7은 BV-2에서 푸코푸로에콜-B의 ROS 저해효과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 7에 나타나듯이,푸코푸로에콜-B는 신경내에서 자유라디칼 소거 효과가 농도의존적인 것을 확인할 수 있다. 비교군인 아스코르빅산과 비교하였을 때, 시료처리농도 50 μg/ml에서 더 높은 라디칼 소거 효과를 보였다.
[0114] 실시예 5 및 6의 결과를 통하여, 대황에서 분리된 베타-시크리테아제 저해물질인 푸코푸로엑콜-B는 베타-아밀로이드로 독성을 유도한 신경아종세포를 효과적으로 보호하는 것으로 나타났다.
[0115] 실시예 7: 신경아종세포에서 아밀로이드 전구 단백질 분해과정에 푸코푸로엑콜-B가 미치는 영향[0116] 베타-아밀로이드는 올리고머(oligomer)를 형성하며 서로 응집하여 신경아종세포의 폐쇄를 유발함으로써 비가역적인 퇴행성 파괴를 일으킨다. 특히 치매 환자의 뇌 및 척수액에서 베타-아밀로이드는 정상인의 경우보다 많이검출된다. 실험에 사용한 SH-SY5Y APP695swe 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 베타-아밀로이드의 분비량이정상세포에 비해 2배 이상 증가되어 있어, 분비저해 활성을 검색하기에 용이하다. SH-SY5Y APP695swe 형태로 형질도입한 세포주로부터 분비되는 베타-아밀로이드의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA를 실시하였다. 1×106
세포를 60 mm dish에서 24시간 배양 후, 배양액을 단백질 분해효소 저해제(protease inhibitor)의 존재 하에 회수하여 시료로 사용하였다. 베타-아밀로이드 특이적 monoclonal antibody 또는 베타-아밀로이드 특이적polyclonal antibody가 각각 코팅(coating)된 플레이트(plate)에 100 ?의 시료를 넣고 4℃에서 16 시간 동안반응시키고 7회 세척한 후, HRPconjugation된 Aβ(11-28) 특이적 monoclonal antibody를 4℃에서 1시간 동안반응시켰다. 다시 9회 세척한 후 tetramethylbenzidine(TMB) 기질액을 넣고 실온에서 30분간 반응시킨 후 정지액 100 ?를 첨가하여 450 nm에서 Microplate Reader(Model680, Bio-Rad, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
푸코푸로엑콜-B를 농도별로 처리한 후 배양액으로 분비된 베타-아밀로이드의 양을 sandwich [0117] ELISA방법으로 배지및 세포내에서 측정하여 비교 정량한 결과를 도8(B)에 나타내었다. 본 발명에서 도 8은 신경아종세포에서 푸코푸로에콜-B가 아밀로이드 전구 단백질 작용에 미치는 영향을 나타내는 그래프로서, 8(B)는 베타-아밀로이드 생성 저해를 나타낸다. 양성 대조군으로는 아스코르빅산을 처리하였다. 푸코푸로엑콜-B를 50 μM 처리시 베타-아밀로이드의 분비량은 각각 음성대조군의 약 49.5, 30.9%이었으며 유의성 있게 감소된 것을 확인할 수 있다.
또한, SH-SY5Y세포에서 발현되는 단백질 분석은 western blot을 이용하였다. 1×106
[0118] 세포를 60 mm dish에서 배양하여 12시간 후에 DMSO에 녹인 푸코푸로엑콜-B를 처리하였다. 24시간 후, 배양액을 상기 조건으로 회수하고PBS로 세척한 세포에 protease inhibitor를 첨가한 cell lysis buffer(RIFA buffer, sigma Aldrich, USA)를 넣고 분쇄하여 시료로 사용하였다. 단백질 50 μg을 12% Tris-glycine SDS-PAGE로 분리한 후, 면역블로팅(immunoblotting)에 의해, sAPPβ(soluble APPβ)의 단백질 양상을 측정하여 도 8(a)에 나타내었다. 상기 도9(a)는 sAPP-베타 생성저해를 나타내는 그래프로, 농도의존적으로 sAPPβ의 단백질 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있다. sAPPβ는 신경아종세포막에 존재하는 아밀로이드 전구단백질인 APP가 베타-시크리타아제의 의해 분해되면서 생성되는 산물로서, 베타-시크리타아제의 작용여부를 측정할 수 있는 지표이다.
[0119] 실시예 8: 신경아종세포에서 항염증효과[0120] 신경아종세포인 BV-2세포를 96-well 플레이트에서 배양하고, 다양한 농도의 푸코푸로엑콜-B 및 베타-아밀로이드를 처리 후 배양을 실시하였다. 상등액 내에서 아질산염(nitrite)의 축적은 동일 부피의 Griess 시약[0.1％ N-(1-naphthyl)-ethylenediamine, 1％ sulfanilamide in 5% phosphoric acid]과 혼합하였고, 상온에서 10 분간인큐베이션하였다. 550 nm에서의 흡광도는 자동화된 마이크로 플레이트 리더 내에서 측정하였으며, 알고 있는도의 나트륨아질산염(sodium nitrite)을 표준물질로 사용하였다. 또한 프로스타글란딘-2의 농도 측정은 신경아종세포인 BV-2 세포를 48-well 플레이트에 24시간 배양하고 24시간 serum starvation한 뒤, 푸코푸로엑콜-B를농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 30 분간 배양하였다. 이후, 베타-아밀로이드를 18 시간 동안 처리하여 배양된 배지 상등액(culturedmedium supernatant)을 취하여 PGE2 ELISA assay를 실시하였다.
[0121] 신경아종세포인 BV-2 세포부터 RNA는 추출은 세포를 회수하고, 총 RNA를 제조자의 지시서에 따라 RNeasyMiNiKit (Quiagen, Valencia, CA)를 사용하여 추출하였다. Superscript pre-amplification system(GIBCO BRL,Grand Island, NY)을 사용하여 RT-PCR을 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. iNOS, COX-2, IL-1β, TNF-α 및GAPDH에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다: 94℃에서 40초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 50초, 이어서, 30사이클을 반복하고 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같았다.표 4
[0122] Primer Sequence
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)
F: 5′-AATGACCCCTTCATTGAC-3′
R: 5′-TCCACGACGTACTCAGCGC-3′
iNOS 5'－AAGCACATGCAGAATGAGTACCG－3'
5'－GTGGGACAGCTTCTGGTCGAT－3'
COX－2 5'－GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC－3'
5'－ATGGTCAGTAGACTTTTACGACTA－3'
TNF－α 5'－CCCCTCAGCAAACCACCAAGT－3'
5'－CTTGGGCAGATTGACCTCAGC－3'
IL－1β 5'－AATCTCACAGCAGCACATCAA－3'
5'－AGCCCATACTTTAGGAAGACA－3'
[0123] PCR 생성물은 TAE(1 mM EDTA를 포함하는 40 mM Tris acetate)내에서 2％ 아가로스 젤을 사용하여전기영동하고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색에 의해 시각화하였다. mRNA의 수준은 대응하는 β-액틴 PCR 산물에 대한 유전자 PCR 산물의 비율로써 표현 하고, 대조군 샘플에 대해 표준화시켰다.
[0124] 신경아종세포인 BV-2세포를 단백질 추출 용액(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)을 사용하여 균질화시킨후 얼음속에서 1시간 정도 인큐베이션하여 용해시키고, 15000 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 단백질 농도를Bradford 방법(Bio-Rad Protein Assay; Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA, USA)으로 측정하고, 동일한양의 단백질(50μg)을 SDS/12％-폴리아크릴아미드 젤상에서 분리하고, Hybond ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(AmershamPharmacia Biotech Inc., Piscataway,NJ, USA)상으로 이동시켰다. 블롯은 TBST[Tris-Buffered SalineTween-20: 10 mM Tris (pH 8.0)과, 0.05％ Tween-20을 포함하는 150 mMNaCl 용액]내의 5％(w/v) 탈지유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. TBST내에서 잠깐 세척한 후에, 멤브레인을 특정의 항체와 함께 상온에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 항체로는 iNOS 및 COX-2에 대한 래빗폴리클로날 항체(1:1000)(CaymanChemical, Ann Arbor, Mich, USA), 및 TNF-α 및 IL-1β 대한 래빗폴리클로날 항체(1:1000)(Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, Calif, USA)를 사용하였다. 이어서, 블롯을 대응하는 컨쥬게이트된 항-래빗 또는 항-마우스 항체(1:10,000 희석, Cell signaling)와 함께 반응시켰다. ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템을 사용하여 면역반응성 단백질을 검출하였다. 단백질밴드의 상대 밀도는 MyImage(SLB)를 사용한밀도측정에 의해 스캔하고 Labworks 4.0 소프트웨어(UVP Inc.)에 의해 정량하였다.
본 발명에서 도 9는 베타-아밀로이드로 염증반응을 유도한 신경아종세포에서 [0125] 푸코푸로에콜-B의 항염증 효과를나타내는 그래프로, (1)은 산화질소 발생량, (2)는 프로스타글란딘-2(PGE2) 발현량, (3)는 염증유도인자인 종양괴사인자알파(TNF-α) 및 인터류킨-베타(IL-1β)의 발현량, 및 (4)는 산화질소합성효(iNOS) 발현 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현량를 나타낸다.
[0126] 측정결과, 푸코푸로엑콜-B는 베타-아밀로이드로 염증반응을 유도한 신경아종세포에서 염증반응 인자인 나트륨아질산염 및 프로스타글란딘-2의 발생량을 감소시켰으며, 염증반응 유도 인자인 iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의발현량을 농도 의존적으로 감소시키므로서, 항염증 효과를 가지는 것으로 나타났다.
[0127] 실시예 9: 신경아종세포 사멸 억제 효과
[0128] 뇌 세포사멸 억제효과를 측정하기 위하여 SH-SY5Y 세포에 베타-아밀로이드로 독성을 유발 시킨 후 세포내 해독효소인 HO-1, 세포사멸억제 유전자인 Bax 및 세포사멸 유전자인 Bcl-2의 발현을 RT-PCR법을 이용하여 측정하였다. HO-1, Bax, Bcl-2 및 GAPDH에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다: 94℃에서 40초, 55℃에서45초 및 72℃에서 50초, 이어서, 30 사이클을 반복하고 72℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 프라이머의 서열은다음과 같았다.
표 5
[0129] Primer Sequence
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)
F: 5'-AATGACCCCTTCATTGAC-3'
R: 5'-TCCACGACGTACTCAGCGC-3'
Heme oxygenase-1 F: 5'-CACGCCTACACCCGCTACCT-3'
R: 5'-TCTGTCACCCTGTGCTTGAC-3'
Bax F: 5'-GGGGACGAACTGGACAGTAA-3'
R: 5'-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3
Bcl-2 F: 5'-CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG-3'
R: 5'-ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG-3'
[0130] PCR 생성물은 TAE(1 mM EDTA를 포함하는40 mM Tris acetate)내에서 2％ 아가로스 젤을 사용하여 전기영동하고,에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색에 의해 시각화하였다. mRNA의 수준은 대응하는 β-액틴 PCR 산물에 대한 유전자 PCR 산물의 비율로써 표현 하고, 대조군 샘플에 대해 표준화시켰다.
[0131] 본 발명에서 도 10은 베타-아밀로이드로 독성을 유도한 신경아종세포에서 푸코푸로에콜-B로 인한 힘옥시게나제(HO-1) 발현 및 세포사멸억제 효과를 나타내는 그래프이다.
[0132] 측정결과, 세포내 해독효소인 HO-1의 발현을 농도의존적으로 증가시켰으며, 신경아종세포의 세포사멸억제효과를bax/bcl-2 비율로 나타내었을 때, 농도의존적으로 세포사멸억제효과가 있음을 알 수 있다.