호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 호산구의 염증성 조절인자는 호산구 세포주인 EoL-1 세포주에서 TLR7에 의해 발현이 증가하고, 호산구 세포가 제거된 동물 모델에서 건선을 유발시키는 이미퀴모드에 의한 증가가 억제되고, 이와 같은 염증성 조절인자의 억제는 호중구 세포를 감소시킨다. 또한, 건선 환자의 병변으로부터 수득된 조직에서 호산구의 세포독성 과립구가 유의적으로 증가함으로써, 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 건선의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

(52) CPC특허분류
A61K 39/395 (2013.01)
A61K 8/606 (2013.01)
A61P 17/06 (2018.01)
A61Q 19/00 (2013.01)
G01N 33/5047 (2013.01)
G01N 33/6863 (2013.01)
A23V 2002/00 (2013.01)
A23V 2200/318 (2013.01)

청구범위
청구항 1
EDN(eosinophil-derived neurotoxin) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,상기 발현 억제제가 EDN 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nuclotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,상기 활성 억제제가 EDN 단백질에 상보적으로 결합하는 항체인 약학적 조성물.
청구항 2                                                                                                                                                                                                                      제1항에 있어서, 상기 EDN 단백질이 호중구의 발현 또는 활성을 증가시키는, 건선의 예방 또는 치료용 약학적조성물.
청구항 3
제1항에 있어서, IL-8(interleukin-8) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 더 포함하고,상기 발현 억제제가 IL-8 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드,siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,상기 활성 억제제가 IL-8 단백질에 상보적으로 결합하는 항체인, 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 4
삭제
청구항 5
삭제
청구항 6
EDN 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,상기 발현 억제제가 EDN 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드,siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,상기 활성 억제제가 EDN 단백질에 상보적으로 결합하는 항체인 건강기능식품.
청구항 7
EDN 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서,상기 발현 억제제가 EDN 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드,siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,상기 활성 억제제가 EDN 단백질에 상보적으로 결합하는 항체인 화장료 조성물.
청구항 8
1) 분화된 호산구 세포에 TLR7 리간드(toll-like receptor 7 ligand) 및 피검 물질을 처리하는 단계;2) 상기 피검물질이 처리된 분화된 호산구 세포의 EDN 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및3) 상기 단계 2)에서 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 호산구 세포의 EDN 단백질의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
청구항 9
제8항에 있어서, 상기 분화된 호산구 세포가 호산구성 과립-함유 세포(eosinophilic granule-containing cell)인, 건선 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
청구항 10
제8항에 있어서, 상기 단계 2)에서 IL-8 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 건선 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 [0001] 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0003] 건선은 면역세포의 침윤 증가 의한 케라틴 세포(keratinocyte)의 비정상적인 증식 및 변화된 분화에 의한 만성염증성 피부질환이다. 비록 건선의 정확한 병인은 알려져 있지 않지만, 항원 자극이 선천성 면역세포의 활성화를 유도하고, 그 결과로 피부에서 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이 생성되어 Th1 및 Th17 세포의 분화를 일으킨다. T 세포가 활성화된 케라틴 세포에서 분비되는 IL-17 및 IL-22는 전염증성 사이토카인 및모카인(chemokine)의 생성을 증가시키고, 이는 건선의 염증 부분을 촉진한다. 건선의 초기 및 발달과정에서선천성 면역반응의 중요한 역할은 건선 치료에 사용되는 항-종양 괴사인자-α(anti-tumor necrosis factor-α,TNF-α)의 효능에 의해 강조된다.
[0004] 선천성 면역 시스템은 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell, DC) 및 과립구(glanulocyte)를 포함하는 다양한 종류의 면역세포에서 발현되는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)를포함하는 생식선 암호화된 패턴 인식 수용체(germline-encoded pattern recognition receptor)를 통해 병원성신호전달을 탐지한다. TLR을 통한 신호는 피부에서 염증 환경의 발달을 촉진함으로써 선천성 및 후천성 면역반응을 형성한다. 이때, TLR1 및 TLR2의 발현은 건선 피부의 케라틴 세포에서 증가하고, 자신의 DNA에 의해 활성화된 TLR9가 선천성 사이토카인의 생성을 유도하는 피부-손상-관련 항균 펩타이드(skin-damage-associatedantimicrobial peptide)와 복합체를 형성한다. TLR7 작용제(agonist)인 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)는 선천성면역반응과 관련된 사이토카인의 생성을 증가시켜 건선을 악화시키고, 마우스 모델에서 건선성 피부염을 유발한다. 한편, 건선 환자의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)에서 TLR3, 7, 8 및 9의 발현증가가 관찰되었고, 이는 손상된 조직에서 배출된 세포 내 리간드와 면역 시스템의 활성화가 관련이 있음을 나타낸다.
[0005] 일반적인 건선의 치료방법은 국소치료, 전신치료 또는 광치료로 나뉘며, 최근에는 건선의 병인에 근거한 다양한면역 생물학 제제들이 개발되고 있다. 또한, 건선 치료 효과는 증가시키면서 부작용은 감소시키기 위해 상기 치료 방법들을 적절히 혼합하는 복합 요법도 많이 사용된다. 가벼운 건선을 치료하기 위해서는 국소 치료제가 가장 많이 사용되고, 이의 단독 요법으로도 좋은 효과를 보는 경우가 많다. 특히, 건선 환자가 소화장애, 간 또는신장장애와 같은 전신질환이 있는 경우에는 전신치료보다 국소치료가 보다 안전하고 효과적이다. 이와관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1492465호는 알콜성 유기산 구리 화합물, 요오드액 및 알콜을 포함하고 폴리에틸렌글리콜 또는 바세린을 이용하여 건선을 치료할 수 있는 약학적 조성물을 개시하고 있다.
호산구(eosinophil)는 전염증성 과립구로서, 알레르기성 질환의 병인, 및 기생충 [0007] 및 바이러스 감염에 대한 방어반응에 관련되어 있다. 성숙한 호산구는 주요 염기성 단백질(major basic protein, MBP), 호산구-유래 신경독(eosinophil-derived neurotoxin, EDN) 및 호산구 양이온 단백질(eosinophil cationic protein, ECP)을 포함하는 세포독성 과립을 갖는다. 호산구는 또한, 다양한 종류의 사이토카인, 케모카인 및 지질 조절인자(lipidmediator)를 방출하는데, 이는 호산구가 다발성의 전염증성 기능에 관여함을 나타낸다. TLR-매개의 호산구 활성화는 TLR7 및 TLR9와 같은 동족체(cognate) 리간드에 의해 자극된 호산구로부터 EDN 및 IL-8의 생성을 증가시킴으로써 몇몇의 전염증성 조절인자의 분비를 유발한다. 이와 같이 염증성 반응에서 호산구의 영향은 몇몇의 연구결과에 의해 보고되었으나, 건선의 병인에서 호산구의 역할은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다.
[0009] 이에, 본 발명자들은 효과적으로 건선을 치료할 수 있는 물질을 개발하기 위해 노력하던 중, 호산구성 과립-함유 세포(eosinophilic granule-containing cell)에 TLR7 리간드를 처리하면 호산구로부터 분비되는 염증성 조절인자의 발현이 증가하며, 호산구 세포가 제거된 마우스를 이용하여 제조된 건선 동물 모델은 야생형의 마우스를 이용하여 제조된 건선 동물 모델에 비해 호산구의 염증성 조절인자의 발현 증가 정도가 유의적으로억제되고, 건선 동물 모델의 각 조직에서 증가한 호중구가 호산구 세포가 제거된 마우스에서 감소하였으며, 호산구로부터 분비된 인자들에 의해 호중구의 분화 및 활성이 증가하고, 건선 환자의 병변으로부터 수득된 조직에서 호산구의 세포독성 과립구가 유의적으로 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌
특허문헌
[0011] (특허문헌 0001) 대한민국 등록특허 제10-1492465호
발명의 내용
해결하려는 과제
[0012] 본 발명의 목적은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제의 건선 치료 용도를 제공하는 것이다.
[0013] 본 발명의 다른 목적은 분화된 호산구 세포에서 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준을 측정함으로써, 건선 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
[0015] 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자(inflammatory mediator)의 발현 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[0016] 또한, 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[0017] 또한, 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
[0018] 나아가, 본 발명은 분화된 호산구 세포에 TLR7 리간드(toll-like receptor 7 ligand) 및 피검 물질을 처리하는단계; 상기 피검물질이 처리된 분화된 호산구 세포의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;및 상기 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 호산구 세포의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
발명의 효과
[0020] 본 발명에 따른 호산구의 염증성 조절인자는 호산구 세포주인 EoL-1 세포주에서 TLR7에 의해 발현이 증가하고,호산구 세포가 제거된 동물 모델에서 건선을 유발시키는 이미퀴모드에 의한 증가가 억제되고, 이와 같은 염증성조절인자의 억제는 호중구 세포를 감소시킨다. 또한, 건선 환자의 병변으로부터 수득된 조직에서 호산구의 세포독성 과립구가 유의적으로 증가함으로써, 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은건선의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 호산구 세포주인 EoL-1 세포주가 호산구의 모델 세포로서 사용할 [0022] 수 있는지 확인하기 위해, TLR7유전자의 발현을 실시간 PCR(A) 및 RT-PCR(B)의 방법으로 확인한 결과 도면이다.
도 2는 낙산염에 의해 분화된 EoL-1 세포주에서 CCR3 및 TLR7 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR의 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 낙산염에 의해 분화된 EoL-1 세포주의 세포 생존율 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 낙산염에 의해 분화된 EoL-1 세포주에 TLR7 리간드를 첨가한 뒤, 염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR로 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 EoL-1 세포주(A) 및 R837을 처리한 분화된 EoL-1 세포(B)에서 염증성 사이토카인의 발현 변화를 단백질어레이 분석(protein array analysis) 방법으로 확인한 결과 도면이다.
도 6은 야생형 마우스(WT) 및 호산구 세포가 제거된 마우스(ΔdblGATA)에 바세린(Control) 또는 IMQ 크림(IMQ)을 도포한 뒤, 건선의 발병 여부를 관찰한 결과 도면이다.
도 7은 야생형 마우스(WT) 및 호산구 세포가 제거된 마우스(ΔdblGATA)에 IMQ 크림(IMQ)을 도포한 뒤, 귀 두께,홍반 및 인설을 평가하여 건선의 발병 정도를 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 야생형 마우스(WT) 및 호산구 세포가 제거된 마우스(ΔdblGATA)에 IMQ 크림(IMQ)을 도포한 뒤, 등의 피부(back skin) 및 귀의 피부(ear skin) 조직을 H&E 염색하여 건선의 발병 정도를 확인한 결과 도면이다.
도 9는 야생형 마우스(WT) 및 호산구 세포가 제거된 마우스(ΔdblGATA)에 바세린(Control) 또는 IMQ 크림(IMQ)을 도포한 뒤, 염증성 사이토카인을 암호화하는 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR로 확인한 결과 그래프이다.
도 10은 야생형 마우스(WT) 및 호산구 세포가 제거된 마우스(ΔdblGATA)에 바세린(Control) 또는 IMQ 크림(IMQ)을 도포한 뒤, 상기 마우스의 피부, 겨드랑이 림프절 및 비장에 존재하는 세포 집단의 조성을 유세포 분석기로 확인한 결과 그래프이다.
도 11은 HL-60 세포주를 일반 배양 배지(HL-60+control media), EoL-1 세포주의 배양 배지(HL-60+EoL-1 UCM)또는 분화된 EoL-1 세포의 배양 배지(HL-60+EoL-1 DRCM)를 이용하여 배양하였을 때의 세포 성장(A) 및 염증성사이토카인을 암호화하는 유전자의 발현 변화(B)를 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 건선 환자의 병변으로부터 수득한 조직에서 호산구의 세포독성 과립구 유전자의 발현 변화를 실시간PCR로 확인한 결과 그래프이다.
도 13은 건선 환자의 병변을 H&E 염색을 수행하여 호중구의 침윤을 확인한 결과 도면이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0023] 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
[0025] 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자(inflammatory mediator)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[0026] 본 명세서에서 사용된 용어, "염증성 조절인자(inflammatory mediator)"는 염증 반응과 관련된 것으로 통상의기술분야에 알려진 사이토카인, 케모카인 등의 인자를 의미한다. 상기 염증성 조절인자는 호산구의 활성화에 의해 분비되는 염증성 조절인자일 수 있고, 구체적으로 TLR-매개의 호산구 활성화로 인해 분비되는 염증성 조절인자일 수 있다. 활성화된 호산구에서 TLR-매개를 통해 분비되는 염증성 조절인자는 통상의 기술분야에 잘 알려져있다.
[0027] 상기 호산구의 염증성 조절인자는 호중구의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 호산구의 염증성 조절인자에의해 증가된 호중구의 발현 또는 활성에 의해 건선이 발병 또는 악화될 수 있다. 상기 호산구의 염증성 조절인자는 IL1B(interleukin-1β), IL23(interleukin-23), IFNG(interferon-γ), IL6(interleukin-6), TNF(tumor
necrosis factor), IL22(interleukin-22), IL17(interleukin-17), IL-8(interleukin-8), IL-1ra(interleukin-
1 receptor antagonist), MIF(macrophage migration inhibitory factor), PAI-1(plasminogen activator
inhibitor type 1), CXCL12(CXC chemokine ligand 12), CCL5(CC chemokine ligand 5), PRG2(proteoglycan 2)
및 EDN(eosinophil-derived neurotoxin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 억제제를 [0028] 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 발현 억제제는 호산구의 염증성 조절인자를 암호화하는 유전자의 mRNA를 억제하는 물질이면 통상에 알려진어떠한 물질도 모두 포함할 수 있다. 상기 발현 억제제는 호산구의 염증성 조절인자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
[0029] 상기 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA는 그 발현을 억제하기 위한 표적 유전자의 mRNA 서열이 공지되었다면 통상의 기술자에 의해 적절히 제조될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 호산구의 염증성 조절인자인 사이토카인, 케모카인 등의 서열은 통상의 기술자에게 자명한 바, 상기 공지된 서열로부터 안티센스 뉴클레오티드,siRNA 및 shRNA를 제조할 수 있다.
[0030] 상기 발현 억제제는 그 활성을 저하시키지 않는 하나 또는 그 이상의 치환, 삽입, 결실 및 그 조합을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 본 발명의 발현 억제제 서열과 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 발현 억제제는 화학적으로 합성하거나, 인비트로 전사를 이용하여 합성하는 등 통상의기술분야에 알려진 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
[0031] 상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭의 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙 mRNA 또는 성숙 mRNA의염기 서열에 상보적으로 결합(혼성화)됨으로써, 염증성 조절인자의 발현을 억제할 수 있다.
[0032] 상기 siRNA는 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNA의 간섭을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 의미한다. 또한,상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중가닥 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분도 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNA 간섭 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면평활 말단 또는 돌출 말단 모두 가능하며, 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출 구조와 5' 말단 돌출 구조 모두 가능하다.
[0033] 상기 shRNA는 이를 구성하는 염기의 루프 영역을 갖는 헤어핀 구조의 이중 가닥 RNA일 수 있다. 이러한 루프 영역의 염기는 당업계에 공지된 것들을 사용할 수 있으며, RNA의 이중 가닥 부분은 상술한 바와 같은 특징을 가질수 있는 siRNA와 동일하게 구성될 수 있다.
[0034] 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 호산구의 염증성 조절인자의 활성 억제제를 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 활성 억제제는 호산구의 염증성 조절인자의 활성을 억제하는 물질이면 통상에 알려진 어떠한 물질도모두 포함할 수 있다. 상기 활성 억제제는 호산구의 염증성 조절인자에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0035] 상기 호산구의 염증성 조절인자의 폴리펩티드 서열은 통상의 기술분야에 잘 알려진 서열일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산환,황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파네실화 등으로 수식될 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드는 공지된 폴리펩티드 서열, 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다.
[0036] 상기 펩티드 및 펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)는 호산구의 염증성 조절인자가 다른 단백질과 결합하는 것을 억제함으로써 호산구의 염증성 조절인자의 활성을 억제하는 것일 수 있다. 펩티드는 단백질의 기능에 영향을미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 비가수분해성 펩티드 미메틱스는 주요 잔기로서 β-턴 디펩티드 코어,케토-메틸렌 슈도펩티드류, 아제핀, 벤조디아제핀, β-아미노알콜 또는 치환 감마락탐환을 사용하여 제조할 수있다.
[0037] 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 특정 단백질에 대한 항체는 단백질의 서열이 공지되어 있다면 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 단일클론 항체는 당업계에 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
상기 다클론항체는 당업계에 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 [0038] 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.
[0040] 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 호산구 세포주인 EoL-1 세포주에 낙산염을 처리하면 상기EoL-1 세포주가 분화하여 분화된 EoL-1 세포, 즉 호산구성 과립-함유 세포로 분화되고, 이때 TLR7 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 2 참조). 또한, 상기 분화된 EoL-1 세포에서 IL1B, IL23, IFNG 등과같은 호산구의 염증성 조절인자의 유전자 발현이 증가하고, IL-1ra, CXCL12, MIF, PAI-1, IL-8과 같은 호산구의염증성 조절인자의 활성이 증가함을 확인하였다(도 4 및 5 참조).
[0041] 한편, 호산구가 제거된 ΔdblGATA 마우스에 IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우에, 야생형의 마우스에IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우보다 건선의 발생 정도가 약함을 귀 두께, 홍반 및 인설 등의 표현형을 관찰함으로써 확인하였다(도 6 내지 8 참조). 또한, 야생형 마우스에 건선을 유발시면 IL6, TNF, IL23,CCL11 등과 같은 다양한 종류의 사이토카인의 발현이 유의적으로 증가하였으나, 호산구가 제거된 마우스에서 상기 증가가 억제되었다(도 9 참조). 나아가, 상기 마우스의 피부, 겨드랑이 림프절 및 비장에 존재하는 세포 집단의 조성을 확인한 결과, 야생형의 건선 모델 마우스에서 증가한 호중구의 수가 ΔdblGATA 건선 모델 마우스에서는 억제됨을 확인하였다(도 10 참조).
[0042] 또한, 본 발명자들은 호산구에 의한 호중구의 분화 및 활성 변화를 확인하고자 일반 배양 배지, EoL-1 세포주의배양 배지 또는 분화된 EoL-1 세포의 배양 배지를 사용하여 HL-60 세포주를 배양한 결과, 분화된 호산구의 배양배지를 이용하여 배양된 HL-60 세포주의 분화 및 활성이 증가하였다(도 11 참조).
[0043] 또한, 건선 환자의 병변부위로부터 수득한 조직에서 호산구의 세포독성 과립구인 PRG2 및 EDN의 발현이 유의적으로 증가하였고(도 12 참조), 호산구가 존재하는 조직 부위에서 호중구의 침윤이 관찰되었다(도 13 참조).
[0044] 따라서, 상기로부터 호산구의 활성화, 구체적으로 호산구에서 분비되는 염증성 조절인자가 건선을 유발 또는 악화시키는 것으로 알려진 호중구의 활성이 유의적으로 증가시킴으로써, 상기 호산구의 염증성 조절인자를 억제하는 물질이 건선의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[0046] 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
[0047] 본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수,링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
[0048] 상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
[0049] 본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 [0050] 등의 주사제가 포함될 수 있다.
[0051] 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
[0052] 본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
[0053] 본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
[0054] 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
[0056] 또한, 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[0057] 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제는 상술한 바와 동일한 특징을 가질 수 있다. 일례로,상기 호산구의 염증성 조절인자는 호중구의 발현 또는 활성을 증가시키는 인자일 수 있고, 구체적으로, IL1B,IL23, IFNG, IL6, TNF, IL22, IL17, IL-8, IL-1ra, MIF, PAI-1, CXCL12, CCL5, PRG2 및 EDN으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0058] 상기 발현 억제제는 호산구의 염증성 조절인자를 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nuclotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
한편, 상기 활성 억제제는 호산구의 염증성 조절인자에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0059] 구체적으로, 본 발명의 실시예에서 본 발명자들은 분화된 EoL-1 세포주에서 TLR7 유전자의 발현이 증가하고,IL1B, IL23, IFNG 등과 같은 호산구의 염증성 조절인자의 유전자 발현이 증가하고, IL-1ra, CXCL12, MIF, PAI-1, IL-8과 같은 호산구의 염증성 조절인자의 활성이 증가함을 확인하였다(도 1, 2, 4 및 5 참조).
[0060] 또한, 호산구가 제거된 ΔdblGATA 마우스에 IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우에, 야생형의 마우스에IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우보다 건선의 발생 정도가 약하였고, 건선의 발병에 의해 증가되는 염증성 조절인자의 발현과 상기 마우스의 조직에 포함된 호중구의 수도 감소하였다(도 6 내지 10 참조).
[0061] 또한, 분화된 호산구를 배양한 배지를 이용하여 HL-60 세포를 배양하는 경우에, HL-60 세포의 분화 및 활성이촉진되었다(도 11 참조).
[0062] 나아가, 건선 환자의 병변부위로부터 수득한 조직에서 호산구의 세포독성 과립구인 PRG2 및 EDN의 발현이 유의적으로 증가하였고(도 12 참조), 호산구가 존재하는 조직 부위에서 호중구의 침윤이 관찰되었다(도 13 참조).
[0063] 따라서, 상기로부터 호산구의 활성화, 구체적으로 호산구에서 분비되는 염증성 조절인자가 건선을 유발 또는 악화시키는 것으로 알려진 호중구의 활성이 유의적으로 증가시킴으로써, 상기 호산구의 염증성 조절인자를 억제하는 물질이 건선의 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[0065] 본 발명의 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로,건강기능식품 중의 함량은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
[0066] 또한, 상기 건강기능식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강기능식품의형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있다.
[0067] 본 발명의 건강기능식품은 통상의 건강기능식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, [0068] 착색제, 펙트산 및 그의 염,알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용 될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
[0070] 또한, 본 발명은 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
[0071] 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제는 상술한 바와 동일한 특징을 가질 수 있다. 일례로,상기 호산구의 염증성 조절인자는 호중구의 발현 또는 활성을 증가시키는 인자일 수 있고, 구체적으로, IL1B,IL23, IFNG, IL6, TNF, IL22, IL17, IL-8, IL-1ra, MIF, PAI-1, CXCL12, CCL5, PRG2 및 EDN으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0072] 상기 발현 억제제는 호산구의 염증성 조절인자를 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nuclotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
한편, 상기 활성 억제제는 호산구의 염증성 조절인자에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0073] 구체적으로, 본 발명의 실시예에서 본 발명자들은 분화된 EoL-1 세포주에서 TLR7 유전자의 발현이 증가하고,IL1B, IL23, IFNG 등과 같은 호산구의 염증성 조절인자의 유전자 발현이 증가하고, IL-1ra, CXCL12, MIF, PAI-1, IL-8과 같은 호산구의 염증성 조절인자의 활성이 증가함을 확인하였다(도 1, 2, 4 및 5 참조).
[0074] 또한, 호산구가 제거된 ΔdblGATA 마우스에 IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우에, 야생형의 마우스에IMQ 크림을 도포하여 건선을 유발시킨 경우보다 건선의 발생 정도가 약하였고, 건선의 발병에 의해 증가되는 염증성 조절인자의 발현과 상기 마우스의 조직에 포함된 호중구의 수도 감소하였다(도 6 내지 10 참조).
[0075] 또한, 분화된 호산구를 배양한 배지를 이용하여 HL-60 세포를 배양하는 경우에, HL-60 세포의 분화 및 활성이촉진되었다(도 11 참조).
[0076] 나아가, 건선 환자의 병변부위로부터 수득한 조직에서 호산구의 세포독성 과립구인 PRG2 및 EDN의 발현이 유의적으로 증가하였고(도 12 참조), 호산구가 존재하는 조직 부위에서 호중구의 침윤이 관찰되었다(도 13 참조).
[0077] 따라서, 상기로부터 호산구의 활성화, 구체적으로 호산구에서 분비되는 염증성 조절인자가 건선을 유발 또는 악화시키는 것으로 알려진 호중구의 활성이 유의적으로 증가시킴으로써, 상기 호산구의 염증성 조절인자를 억제하는 물질이 건선의 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[0079] 본 발명의 화장료 조성물은 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제를 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 건선의 개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.
[0080] 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액,유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수,영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.
[0081] 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르등을 더 포함할 수 있다.
[0082] 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 [0083] 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이드, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
[0084] 본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.
[0086] 나아가, 본 발명은 분화된 호산구 세포에 TLR7 리간드(toll-like receptor 7 ligand) 및 피검 물질을 처리하는단계; 상기 피검물질이 처리된 분화된 호산구 세포의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;및 상기 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 호산구 세포의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준을 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 건선 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
[0087] 상기 분화된 호산구 세포는 통상의 기술자에 의해 적절히 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 분화된 호산구 세포는 호산구성 과립-함유 세포(eosinophilic granule-containing cell)일 수 있다. 상기 TLR7 리간드는 통상의기술자에 의해 적절히 선택되어 사용될 수 있다.
[0088] 상기 호산구의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 억제제는 상술한 바와 동일한 특징을 가질 수 있다. 일례로,상기 호산구의 염증성 조절인자는 호중구의 발현 또는 활성을 증가시키는 인자일 수 있고, 구체적으로, IL1B,IL23, IFNG, IL6, TNF, IL22, IL17, IL-8, IL-1ra, MIF, PAI-1, CXCL12, CCL5, PRG2 및 EDN으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[0089] 상기 호산구 세포의 염증성 조절인자의 발현 또는 활성 수준은 면역침강법, 방사선 면역분석법,소면역분석법, 면역조직화학, RT-PCR, 실시간 PCR, 웨스턴블랏 또는 유세포 분석법으로 측정할 수 있으나, 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 방법이라면 모두 사용할 수 있다.
[0091] 이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
[0093] 실시예 1. 호산구의 모델 세포로서 EoL-1 세포주의 사용 가능 여부 확인
[0094] 인간 호산구 세포주(eosinophilic cell line)인 EoL-1 세포주는 호산구의 연구에 유용하게 사용되고 있으며, 낙산염 자극에 의해 호산구성 과립-함유 세포(eosinophilic granule-containing cell)로 분화가 가능하다. 따라서, 상기 EoL-1 세포주를 호산구의 모델 세포로 사용할 수 있는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
[0095] 먼저, EoL-1(DSMZ, 독일) 및 HL-60(ATCC, 미국) 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 1640 배양 배지(Sigma-Aldrich, 미국)를 이용하여 5% CO2 및 37℃ 조건하에서 배양하였다. 한편, HaCaT 세포주(ATCC,미국)는 DMEM 배양 배지(Sigma-Aldrich, 미국)를 이용한 것을 제외하고, 상기와 동일한 방법으로 배양하였다.
배양된 EoL-1, HL-60 및 HaCaT 세포주를 각각 원심분리하여 세포를 수득하고, QIAzol®세포용해 시약(Qiagen,독일) 및 RNeasy®미니 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 수득된 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 500 ng의추출된 RNA에 DNase I 효소(New England Biolabs, 미국)를 처리하고, iScript™ cDNA 합성 키트(Bio-RadLaboratories, 미국)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, 하기 표 1에 기재된 TLR7-F 및 TLR7-R 프라이머, 및 iQ SYBR®그린 수퍼믹스(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 사용하여 통상적인 방법으로 실시간 PCR을수행하였다. 이때, 기기는 CFX Connect™ 실시간 PCR 탐지 시스템(Bio-Rad Laboratories, 미국)을, 대조군으로GAPDH 유전자를 사용하였다.
표 1
[0096] 프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
TLR7-F GCT CTG TGG GAG TTC TGT CC 서열번호 1
TLR7-R ACC GTT TCC TTG AAC ACC TG 서열번호 2
CCR3-F GTC ATC ATG GCG GTG TTT TTC 서열번호 3
CCR3-R CAG TGG GAG TAG GCG ATC AC 서열번호 4
GAPDH-F CTG GTA TGA CAA TGA ATA CGG 서열번호 5
GAPDH-R GCA GCG AAC TTT ATT GAT GG 서열번호 6
또한, 동시에 상기 합성된 cDNA, 상기 표 1에 기재된 TLR7-F 및 TLR7-R 프라이머, 및 AccuPower®[0098] PCR 프리믹스(Bioneer, 대한민국)를 사용하여 RT-PCR을 수행하고, 그 결과를 2% 아가로스겔에 전기영동함으로써 확인하였다.
이때, 대조군으로 GAPDH 유전자를 사용하였다.
[0099] 그 결과, 도 1A 및 1B에 나타난 바와 같이, HaCaT 및 HL-60 세포주와 달리 EoL-1 세포주에서 TLR7 유전자의 발현이 현저히 높았다(도 1).
[0101] 실시예 2. 낙산염(butyrate)에 의해 분화된 EoL-1 세포에서 TLR7 유전자의 발현 증가 확인
[0102] 종래 연구에 의하면, 낙산염이 처리된 EoL-1 세포주는 성숙된 호산구 마커인 CCR3(CC-chemokine receptor 3)유전자의 발현이 증가한다고 보고되었다. 따라서, 낙산염의 처리에 의해 EoL-1 세포에서 TLR7 유전자의 발현 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
[0103] 먼저, 실시예 1에서 배양된 EoL-1 세포주에 0.5 μM의 낙산염을 처리하고, 처리 2, 4 및 6일 후에 세포를 수득하였다. 수득된 세포 및 상기 표 1에 기재된 CCR3 및 TLR7 유전자에 대한 프라이머를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 조건 및 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 대조군으로는 GAPDH 유전자를사용하였다.
[0104] 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 낙산염을 처리한 EoL-1 세포주에서 CCR3 및 TLR7 유전자의 발현이 모두 증가하였고, 특히, 낙산염을 처리하고 배양 2일 후에 두 유전자의 발현량이 가장 높았다(도 2).
[0106] 실시예 3. 낙산염에 의한 세포 생존율 변화 확인
[0107] 낙산염이 EoL-1 세포주의 세포 생존율에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 방법으로 유세포분석을 수행하였다.
[0108] 먼저, 실시예 1에서 배양된 EoL-1 세포주에 0.5 μM의 낙산염을 처리하고, 처리 2, 4 및 6일 후에 세포를 수득하였다. 수득된 세포에 7-아미노-액티노마이신 D(7-amino-actinomycin D)를 처리하여 세포를 염색함으로써, 분화된 EoL-1 세포주의 생존율을 확인하였다.
[0109] 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 낙산염 처리시간 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다(도 3). 따라서, 상기로부터 TLR7 유전자의 발현이 가장 높은, 낙산염을 처리하고 2일 후의 세포를 분화된 EoL-1 세포로서 앞으로의 실험에 사용하기로 결정하였다.
[0111] 실시예 4. 분화된 EoL-1 세포에서 TLR7 리간드에 의한 염증성 사이토카인 유전자의 발현 변화 확인[0112] 낙산염을 처리하고 2일 후, 분화된 EoL-1 세포에 TLR7 리간드를 처리한 뒤, 염증성 사이토카인인 IL1B, IL23,IL6, TNF, IFNG 및 IL13 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR 방법으로 확인하였다.
[0113] 먼저, EoL-1 세포주 및 분화된 EoL-1 세포에 1 ㎍/㎖의 R837(Invivogen, 미국)을 처리하고 24시간을 배양하여준비하였고, 대조군으로서는 R837을 처리하지 않은 EoL-1 세포주 및 분화된 EoL-1 세포를 준비하였다. 상기 준비된 4종류의 세포(EoL-1 세포주, R837을 처리한 EoL-1 세포주, 분화된 EoL-1 세포 및 R837을 처리한 분화된EoL-1 세포)와 하기 표 2에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법 및조건으로 수행하였다. 이때, 대조군으로는 GAPDH 유전자를 사용하였다.
표 2
[0114] 프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
IL1B-F ATG ATG GCT TAT TAC AGT GGC AA 서열번호 7
IL1B-R CCC TTG CAC AGT TTG ACT CTC 서열번호 8
IL23-F GTC TCC TTC TCC GCT TCA 서열번호 9
IL23-R TTA GGG ACT CAG GGT TGC 서열번호 10
IL6-F GAC AGC CAC TCA CCT CTT CAG A 서열번호 11
IL6-R GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC 서열번호 12
TNF-F TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CA 서열번호 13
TNF-R GGT TGA GGG TGT CTG AAG GA 서열번호 14
IFNG-F TGT CAC ATT GGG CAA AGT T 서열번호 15
IFNG-R TCG CTT CCC TGT TTT AGC TGC 서열번호 16
IL13-F TGT TTG TCA CCG TTG GGG AT 서열번호 17
IL13-R TGA GTC TCT GAA CCC TTG GC 서열번호 18
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, EoL-1 세포주에 비해 분화된 EoL-1 세포에서는 IL1B, [0116] IL23 및 IFNG 유전자의 발현이 증가하였다. 또한, TLR7 리간드를 처리한 분화된 EoL-1 세포에서는 낙산염에 의해 유도되는 상기 사이토카인 유전자의 발현이 더욱 증가하였다. 한편, IL6, TNF 및 IL13 유전자는 낙산염이나 TLR7 리간드의 처리에 의해서도 유의적인 발현 변화가 없었다(도 4).
[0117] 따라서, 상기로부터 TLR7 리간드는 분화되지 않은 EoL-1 세포주의 사이토카인 발현에는 유의적인 영향을 미치지않음을 확인하였다.
[0119] 실시예 5. 분화된 EoL-1 세포에서 TLR7 리간드에 의한 염증성 사이토카인의 발현 변화 확인
[0120] 분화된 EoL-1 세포에서 TLR7 리간드에 의해 발현이 증가하는 염증성 사이토카인을 더 확인하기 위해, 단백질 어레이 분석을 수행하였다.
[0121] 먼저, EoL-1 세포주 및 R837을 처리한 분화된 EoL-1 세포로부터 각각 배양액을 수득하였다. 이어, 수득된 배양액과 인간 사이토카인 어레이 키트(R&D system)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 염증성 사이토카인의 발현 변화를 확인하였다.
[0122] 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, EoL-1 세포주(A)에 비해 R837을 처리한 분화된 EoL-1 세포(B)에서 호중구의활성, 주화성 및 생존에 관여하는 CXC 케모카인 리간드 12(CXCL12), IL-8, MIF(microphage migrationinhibitory factor), 및 PAI-1(plasminogen activator inhibitor type 1)의 발현이 현저히 증가하였다. 또한,IL-1ra(IL-1 receptor antagonist)의 발현 또한 R837을 처리한 분화된 EoL-1 세포에서 증가하였다(도 5).
[0123] 결론적으로, 상기로부터 R837을 처리한 분화된 EoL-1 세포에서 다양한 염증성 조절인자의 생산이 증가하는 것을확인함으로써, 호산구가 건선의 병인에서 중요한 역할을 할 수 있음을 예측할 수 있었다.
[0125] 실시예 6. 호산구가 제거된 마우스 모델을 이용한 건선과 호산구의 병인관계 확인
[0127] 6-1. 건선 동물 모델의 제조 및 발생 정도 확인
[0128] 건선과 호산구의 병인관계를 더욱 명확하게 확인하기 위해, 호산구 계통의 세포가 제거된 마우스 모델인 ΔdblGATA 마우스를 이용하여 건선 동물 모델을 제조하였다.
[0129] 먼저, BALB/c 마우스(오리엔탈바이오, 대한민국) 및 ΔdblGATA 마우스(Jackson Laboratory, 미국)를 표준 실험실 조건하에서 사육하여 준비하였다. 8 내지 10주령의 ΔdblGATA 마우스에게 IMQ 크림(5%)(Aldara™, 3MPharmaceuticals, 미국)을 62.5 ㎎의 양으로 1일 1회 국소도포하였다. 이때, IMQ 크림은 마우스 털이 제거된 등및 오른쪽 귀에 6 내지 8일 동안 매일 도포하였다. 한편, 대조군 마우스에는 바셀린(Uniever, 네덜란드)을 도포하였다. 모든 실험은 동물 복지를 위한 가이드라인에 따라 수행되었다.
[0130] 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스 및 ΔdblGATA 마우스 모두에서 건선의 표현형이 관찰되었으나, 호산구가 제거된 마우스에서 건선의 정도가 약하였다(도 6).
[0131] 또한, 상기 마우스에 IMQ 크림을 도포하는 2, 4, 6 및 8일째에 마우스의 귀 두께, 홍반 및 인설(scale)을 측정하였다. 마우스의 귀 두께는 ㎜ 단위로 나타내었고, 홍반 및 인설은 각각 5점 척도를 기준으로 평가하였다(0:없음, 1: 약함, 2: 보통, 3: 두드러짐, 4: 매우 두드러짐).
[0132] 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스에 비해 ΔdblGATA 마우스에서 귀 두께가얇고, 홍반 및 인설의 약하게 발생함으로써, ΔdblGATA 마우스에서 건선의 정도가 약한 것을 확인하였다(도 7).
6-2. 조직 [0134] 염색을 통한 건선의 발생 정도 확인
[0135] 실시예 6-1에서 제조된 건선 동물 모델로부터 수득된 조직의 표피 두께를 확인함으로써, 건선의 발생 정도를 재확인하였다.
[0136] 먼저, 실시예 6-1에서 제조된 IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스 및 ΔdblGATA 마우스로부터 귀 및 등의 조직을취하고, 이를 10% 포르말린에 고정시킨 뒤, 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 4 ㎛의 두께로 절편화하고, 여기에 H&E 염색약을 처리함으로써 조직을 염색하였다. 염색된 조직은 CX41 현미경(Olympus, 일본)으로 관찰하였다.
[0137] 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, IMQ 크림을 도포하지 않은 마우스에 비해 IMQ를 도포한 마우스의 피부가 두꺼웠다. 한편, IMQ 크림을 도포한 경우, BALB/c 마우스에 비해 ΔdblGATA 마우스의 피부 두께가 덜 두꺼움으로써, ΔdblGATA 마우스에서 건선의 정도가 약한 것을 확인하였다(도 8).
[0138] 따라서, 상기로부터 호산구가 제거된 마우스에서 건선의 발생정도가 유의적으로 약함을 알 수 있었다.
[0140] 6-3. 염증성 사이토카인 유전자의 발현 정도 확인
[0141] 실시예 6-1에서 제조된 건선 동물 모델에서 다양한 종류의 염증성 사이토카인 유전자의 발현 정도를 실시간 PCR로 확인하였다. 실험은, 실시예 6-1에서 제조된 건선 동물 모델의 조직으로부터 수득된 RNA와 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
표 3
[0142] 프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
IL1B-2F GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T 서열번호 19
IL1B-2R ATC TTT TGG GGT CCG TCA ACT 서열번호 20
IL6-2F TAG TCC TTC CTA CCC CAA TT 서열번호 21
IL6-2R TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC 서열번호 22
TNF-2F CCT GTA GCC CAC GTC GTA G 서열번호 23
TNF-2R GGG AGT AGA CAA GGT ACA ACC C 서열번호 24
IL22-F ACC AGA ACA TCC AGA AGA AT 서열번호 25
IL22-R CTC AGA CGC AAG CAT TTC 서열번호 26
IL23-2F CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG 서열번호 27
IL23-2R CTG GCT GTT GTC CTT GAG 서열번호 28
IL17-F TCA GCG TGT CCA AAC ACT GAG 서열번호 29
IL17-R CGC CAA GGG AGT TAA AGA CTT 서열번호 30
CXCL2-F CCA ACC ACC AGG CTA CAG G 서열번호 31
CXCL2-R GCG TCA CAC TCA AGC TCT G 서열번호 32
CCL5-F AAG TGT GTG CCA ACC CAG AG 서열번호 33
CCL5-R CAA GCT GGC TAG GAC TAG AGC 서열번호 34
CCL11-F AGC TAG TCG GGA GAG CCT AC 서열번호 35
CCL11-R AAG GAA GTG ACC GTG AGC AG 서열번호 36
[0144] 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, IMQ 크림을 도포하지 않은 마우스에 비해 IMQ를 도포한 마우스에서, 건선에중요한 사이토카인으로 알려진 IL1b, IL6, TNF, IL22, IL23 및 IL17 유전자와, T 세포 및 백혈구의 이동을 촉진하는 케모카인인 CXCL12 및 CCL5 유전자의 발현이 증가하였다. 그러나, IMQ 크림을 도포한 경우에 BALB/c 마우스에 비해서 ΔdblGATA 마우스에서 대부분의 사이토카인 및 케모카인 유전자의 발현이 유의적으로 낮았으나,TNF 및 CCL11 유전자의 발현은 유의적인 차이가 없었다. 또한, IL6 및 IL23 유전자의 발현은 IMQ 크림을 도포하지 않아도 ΔdblGATA 마우스에서 유의적으로 낮았다(도 9).
[0145] 따라서, 상기로부터 호산구가 염증성 조절인자의 세포 내 소스(source)임을 알 수 있었다.
[0147] 6-4. IMQ 크림 도포에 의한 호중구의 조직으로의 침투 확인
[0148] 건선 동물 모델의 피부, 겨드랑이 림프절 및 비장에 존재하는 세포 집단의 조성을 유세포 분석기로 확인하였다.
[0149] 먼저, 실시예 6-1에서 제조된 IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스 및 ΔdblGATA 마우스의 피부 조직을 수득하고,수득된 조직을 0.2% 콜라게나제 D(collagenase D), 10 ㎍/㎖의 DNase I(Roche) 및 10% FCS(fetal calf serum)를 포함하는 RPMI 1640 배양 배지에 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 조직을 세척하고세척된 세포를 40/75% Percoll®(Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하여 밀도차등 원심분리(density-gradientcentrifugation)하여 세포룰 수득하였다. 한편, 상기 마우스로부터 겨드랑이 림프절 및 비장을 수득하고, 이를부드럽게 부수어 나일론 망사(mesh)로 여과함으로서 응집체를 제거된 비장 세포를 겨드랑이 림프절 및 비장으로부터 각각 수득하였다. 수득된 비장 세포를 암모늄-클로라이드-포타슘 용해 완충액(ammonium-chloridepotassiumlysis buffer)에 재현탁하여 적혈구를 제거하고, 원심분리하여 세포만 수득하였다.
상기에서 피부, 겨드랑이 림프절 및 비장으로부터 수득된 각각의 세포를 FACS 완충액(10% [0150] FCS, 20 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설포닉 에시드 및 10 mM EDTA를 포함하는 PBS)에 현탁하였다. 여기에 항-마우스CD16/CD32 항체(2.4G2, BD Biosciences, 미국)를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 전처리한 뒤, CD4(RM4-5, BDBiosciences, 미국), SiglecF(E50-2440, BD Biosciences, 미국), CD317(eBio927, eBioscience, 미국), Gr-1(RB6-8C5, BioLegend) 및 F4/80(BM8, BioLegend)에 대한 1차 항체를 각각 첨가하여 반응시켰다. 4℃에서 30분동안 반응시킨 뒤, 반응이 끝난 세포를 FACSCalibur™ 유세포 분석기(BD Biosciences, 미국)를 사용하여 측정하고, 그 결과는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, 미국)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, Gr-1+[0151] 호중구만이 IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스 및 ΔdblGATA 마우스의 분석된 모든 조직으로 침투하였고, 이때, Gr-1+호중구는 BALB/c 마우스에 비해 ΔdblGATA 마우스에서 유의적으로 적었다. 또한, CD317+수지상 세포 및 F4/80+대식세포는 IMQ 크림을 도포한 경우, BALB/c 마우스에비해 ΔdblGATA 마우스의 비장에서 그 수가 적었다. 한편, CD4+T 세포는 BALB/c 마우스 및 ΔdblGATA 마우스모두의 피부에서 IMQ 크림을 도포한 후에 증가하였으나, 이들 사이에 유의적인 차이를 보이지는 않았다.
SiglecF+호산구의 경우, IMQ 크림을 도포한 BALB/c 마우스의 피부에서 유의적으로 증가하였으나, 겨드랑이 림프구 및 비장에서는 차이를 나타내지 않았다. 또한, 피부, 겨드랑이 림프구 및 비장에 존재하는 호산구의 절대적인 세포 수가 다른 종류의 세포에 비해 훨씬 적은 것을 고려하면, 호산구가 IMQ 자극에 기초하여 염증성세포, 특히 호중구의 침투를 촉진함을 알 수 있다(도 10).
[0153] 실시예 7. 호산구와 호중구의 상관관계 확인
[0154] 호산구가 분비하는 인자들이 호중구에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
[0155] 구체적으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이 HL-60 세포주를 배양하여 준비하였다. 준비된 HL-60 세포주를 EoL-1세포주 또는 분화된 EoL-1 세포를 배양한 배지를 이용하여 24시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군은 실시예 1에기재된 배양 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배양된 세포를 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 세포분화 정도를 확인하였다. 또한, 상기 배양된 세포 및 상기 표 3에 기재된 프라이머를 이용하여, IL1B, IL23,IL6 및 TNF 유전자의 발현을 실시간 PCR로 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
[0156] 그 결과, 도 11A에 나타난 바와 같이, 분화된 EoL-1 세포를 배양한 배지를 이용하여 배양한 HL-60 세포주의 분화가 대조군 또는 EoL-1 세포주를 배양한 배지에서 배양한 HL-60 세포주에 비해 현저히 증가하였다(도 11A). 또한, 분화된 EoL-1 세포를 배양한 배지를 이용하여 배양한 HL-60 세포주에서 IL1B, IL6 및 TNF 유전자의 발현도현저히 증가하였다(도 11B).
[0157] 따라서, 상기로부터 TLR7이 자극된 염증성 조건하에서 호산구로부터 분비된 인자들이 호중구의 분화 및 활성을촉진함을 알 수 있었다.
[0159] 실시예 8. 건선 환자에서의 호산구 및 호중구의 관련 확인
[0161] 8-1. 호산구 세포독성 과립구의 발현 변화 확인
[0162] 건선 환자로부터 수득된 피부 조직에 존재하는 호산구의 세포독성 과립구 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR을사용하여 확인하였다.
[0163] 먼저, 건선을 진단받은 42명의 환자(남자 30명, 여자 12명)의 병변 부위에서 피부 조직을 수득하였다. 임상은모든 환자의 동의를 얻어서 수행되었으며, 가천대학교 길의료재단의 윤리위원회로부터 승인받아 진행되었다. 수득된 조직과 상기 표 1 및 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 대조군으로서는 양성 종양 환자를 수술할 때 수득한 정상 피부 조직을 사용하였다(남자 13명, 여자 9명).
표 4
[0164] 프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
PRG2-F AAA CTC CCC TTA CTT CTG GCT 서열번호 37
PRG2-R GCA GCG TCT TAG CAC CCA A 서열번호 38
EDN-F TGT GGT AAC CCA AAT ATG ACC TG 서열번호 39
EDN-R GGT CTC GTC GTT GAT CTC TGT 서열번호 40
ECP-F CCT CAT AAC AGA ACT CTC AAC A 서열번호 41
ECP-R GCA ACT ACA TAG AAC CTC CTT 서열번호 42