특허권

방사선 조사를 이용하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강하고 성장속도가 높은 해캄 8GY 및 이의 제조방법

상품번호 2019052106313693
IPC 한국(KO) 등록
출원번호 1020100069052
등록번호 1011071000000
출원인 한국원자력연구원
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본 발명은 해캄( Spirogya )에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, 통상의 해캄에 비해 성장속도가 높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 많은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄 8GY( Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP), 이의 제조방법에 관한 것이다.

특허청구의 범위
청구항 1
해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, 통상의 해캄에 비해 성장속도가높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP).
청구항 2
제1항에 있어서, 해캄에 방사선의 조사는 1~10kGy의 흡수선량으로 조사하는 것을 특징으로 하는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)
청구항 3
제1항에 있어서, 방사선은 감마선, X-선, 알파선, 베타선 및 전자선 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로하는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)
청구항 4
해캄(Spirogya)에 방사선을 조사한 후 배지에 옮겨 배양하여 생존한 해캄을 선별하는 단계;상기 방사선 조사 후 생존한 해캄을 배지에서 배양하여 얻은 후 방사선을 조사하지 않은 해캄과 대비시 산화적환경에 대한 저항성, 성장속도, 전분의 함량 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성이 향상된 것을 선별하는 것을 특징으로 하는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법.
청구항 5
제4항에 있어서, 해캄에 방사선의 조사는 1~10kGy의 흡수선량으로 조사하는 것을 특징으로 하는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법.
청구항 6
제4항에 있어서, 방사선은 감마선, X-선, 알파선, 베타선 및 전자선 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법.
청구항 7
항산화 추출물의 추출방법에 있어서,청구항 제1항의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 또는 청구항 제4항에 의해 제조한 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 주재료로 하여 항산화 추출물을 추출하는 방법.
청구항 8
전분의 추출방법에 있어서,
청구항 제1항의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 또는 청구항 제4항에 의해 제조한 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 주재료로 하여 전분을 추출하는 방법.
명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 [0001] 강한 특성, 통상의 해캄에 비해성장속도가 높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 많은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP), 이의 제조방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
육상자원의 고갈이 예견되는 21세기의 세계는 육상 이외에서 얻을 수 있는 [0002] 자원에 대해 연구하고 있으며, 지구의 70% 이상이 수계이므로 수계 생물자원 개발에 초미의 관심을 가지고 있고 이러한 수계(water system) 생물자원은 대체에너지, 대체식품과 의약품 개발이라는 산업적으로 이용 가치가 높은 미세조류(microalgae)로 눈을돌리고 있다.
[0003] 수계에 존재하는 생물 중에 미세조류는 수계 생태계의 먹이 연쇄에서 가장 중요한 기본 단위가 되며 기초 영양원을 생산하는 생산자로서 먹이, 생체량, 에너지 피라밋의 중요 하부단계를 구성하는 주요 생물이다. 계통분류학적으로 육상고등식물계와 박테리아와 같은 미생물계의 특성의 중간 영역에 속하는 식물플랑크톤은 고등식물과같은 광합성 기능을 가지며 명반응에 속하는 광계I & Ⅱ와 암반응에 속하는 제2차 대사산물인 알칼로이드, 테르페노이드, 페놀류, 항생물질, 색소 등의 기초과학적 연구와 양식 패류 및/또는 어류의 사료 개발 및 여러 응용가치가 높은 산업적인 연구를 위해 널리 이용되고 있다. 또한 조류는 광합성을 통해 이산화탄소(CO2)를 소비하여산소(O2)를 생산하며 이러한 산소 생성 과정에서 산소 생성 이외에 생성된 광합성 산물은 전분형태로 엽록체나세포내에 저장된다. 전분은 여타의 바이오에탄올 생산에 이용되는 셀룰로오스(cellulose), 리그닌(lignin) 그리고 헤미셀룰로오스(hemicellulose)에 비해 당화가 쉬워 바이오에탄올 생산에 유리하다.
[0004] 조류중에서 해캄(Spirogya)은 현미경으로 관찰하면 1줄로 늘어선 세포들이 깨끗한 녹색을 띤 색소체를 세포 내에 나선 모양으로 가지고 있으며, 그 색소체에는 피레노이드(pyrenoid)가 흰 점처럼 곳곳에 박혀 있는 것을 볼수 있다. 해캄은 세포가 분열하면서 자라기 때문에 때로는 1m가 넘게 긴 사상체를 이루기도 하며, 몸이 절단되면 각 도막마다 세포분열로 자라 새로운 개체를 이룬다. 유성생식은 드물게 볼 수 있는데, 사상을 이룬 두 세포열이 나란히 서서 서로 마주 대하는 세포끼리 내용물을 주고받으며 접합(接合)하여 전체적으로 사다리꼴을 이루게 된다. 이처럼 접합하여 형성된 접합자(接合子)는 감수분열을 통하여 새로운 개체가 발생한다.
[0005] 일반적으로 호수나 연못 등지에서 대량으로 발생되는 해캄은 수중바닥에 부착하며 성장하거나 저층에서 떨어져나와 뒤얽힌 사상체의 부유 더미를 이루며 수면에서 자라기도 한다. 이렇게 성장하는 해캄은 질소, 인 등의 영양물질을 대량으로 흡수함으로써, 마이크로시스티스 종(Microcystis sp.)과 같은 독소를 함유하는 병원성 조류의 성장을 억제하는 장점을 가지고 있다.
[0006] 이와 같이 해캄은 수중 생태계에 중요한 구성원으로 작용하고 있지만, 최근 수질 오염으로 인하여 성장이 저해되고 있으며, 이로 인한 해캄의 성장 저해, 수질 오염 등에 의해 수중 생태계 파괴가 진행되고 있다.
[0007] 이에 본 발명자는 해캄에 대해 연구하던 중 해캄에 방사선 조사를 통하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, 통상의 해캄에 비해 성장속도가 높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 얻고 이러한 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법 및 용도를 제공할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하였다.
발명의 내용
해결하려는 과제
[0008] 본 발명의 목적은 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, 통상의 해캄에 비해 성장속도가 높은 특성, 통상의해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 제공하고자 한다.
[0009] 본 발명의 다른 목적은 상기에서 언급한 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법을 제공하고자 한다.
[0010] 본 발명의 또 다른 목적은 상기에서 언급한 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)으로부터 항산화 물질 및/또는 전분을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
과제의 해결 수단
본 발명은 해캄에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, [0011] 통상의 해캄에 비해 성장속도가높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 제공할 수 있다.
[0012] 본 발명은 상기에서 언급한 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법을 제공할 수 있다.
[0013] 본 발명은 상기에서 언급한 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)으로부터 항산화 물질 및/또는 전분을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
발명의 효과
[0014] 본 발명의 해캄에 방사선을 조사하여 얻은 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 산화적 환경에 대한 저항성이 강하여 고부가가치의 항산화 추출물을 제공할 수 있으며, 산화적 환경에서 성장이 우수하여 성장속도가 빠르기 때문에 수질 오염이 심각한 환경에서 성장하여 수질오염의 정화 또는 수질오염을 방지할 수 있으며, 전분의 함량이 높아 바이오연료로서 사용될 수 있는 전분을 보통의 해캄에 비해 많이
제공할 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0015] 도 1은 모균주 해캄(a)과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)(b)의 성장속도 비교를 나타낸 그래프이다.
도 2는 모균주 해캄(a)과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)(b)의 전분 함량을 나타낸 사진이다.
도 3은 모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 나타낸 사진이다.
도 4a는 모균주 해캄의 발현된 단백질의 프로테옴 분석 사진이고, 도 4b는 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의발현된 단백질의 프로테옴 분석 사진이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0016] 본 발명은 해캄에 방사선을 조사하여 보통의 해캄에 비해 우수한 특성을 지니는 해캄 8GY(Spirogya varians8GY)(KCTC 11713BP)을 나타낸다.
[0017] 본 발명은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 나타낸다.
[0018] 본 발명은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 통상의 해캄에 비해 성장속도가 높은 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 나타낸다.
[0019] 본 발명은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 나타낸다.
[0020] 본 발명은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사하여 산화적 환경에 대한 저항성이 강한 특성, 통상의 해캄에 비해성장속도가 높은 특성, 통상의 해캄에 비해 전분의 함량이 높은 특성 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을지니는 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 나타낸다.
[0021] 본 발명에서 해캄에 방사선의 조사는 1~10kGy의 흡수선량으로 조사하여 상기에서 언급한 특성을 지니는 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 얻을 수 있다.
[0022] 상기에서 해캄에 방사선을 조사시 방사선은 감마선을 사용할 수 있다.
[0023] 상기에서 해캄에 방사선을 조사시 방사선은 X-선을 사용할 수 있다.
[0024] 상기에서 해캄에 방사선을 조사시 방사선은 알파선을 사용할 수 있다.
상기에서 해캄에 방사선을 조사시 [0025] 방사선은 베타선을 사용할 수 있다.
[0026] 상기에서 해캄에 방사선을 조사시 방사선은 전자선을 사용할 수 있다.
[0027] 본 발명은 해캄에 방사선을 조사한 후 생존한 해캄중에서 보통의 해캄에 비해 산화적 환경에 대한 저항성, 성장속도 및/또는 전분의 함량 등의 특성이 우수하거나 많은 해캄을 선별하여 이를 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)로 명명하였으며, 2010년 6월 21일 한국유전자은행(KCTC)에 KCTC 11713BP의 기탁번호로 기탁하였다.
[0028] 본 발명은 해캄에 방사선을 조사한 후 생존한 해캄이 보통의 해캄에 비해 산화적 환경에 대한 저항성이 4배 이상 높고, 성장속도가 1.5배 이상으로 높으며 및/또는 전분의 함량이 많은 해캄을 선별하여 이를 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)로 명명하였으며, 2010년 6월 21일 한국생명공학원내 생명자원관리본부(KCTC)에KCTC 11713BP의 기탁번호로 기탁하였다.
[0029] 본 발명의 해캄에 방사선을 조사한 후 생존한 해캄이 보통의 해캄에 비해 산화적 환경에 대한 저항성, 성장속도및/또는 전분의 함량 등의 특성이 우수하거나 많은 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)의 제조방법은 해캄(Spirogya)에 방사선을 조사한 후 배지에 옮겨 배양하여 생존한 해캄을 선별하는 단계;
[0030] 상기 방사선 조사 후 생존한 해캄을 배지에서 배양하여 얻은 후 방사선을 조사하지 않은 해캄과 대비시 산화적환경에 대한 저항성, 성장속도, 전분의 함량 중에서 선택된 어느 하나 이상의 특성이 향상된 것을 선별하여 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 제조하는 방법을 나타낸다.
[0031] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 대한 방사선의 조사는 1~10kGy의 흡수선량으로 조사할 수 있다.
[0032] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 조사하는 방사선은 감마선을 사용할수 있다.
[0033] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 조사하는 방사선은 X-선을 사용할 수있다.
[0034] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 조사하는 방사선은 알파선을 사용할수 있다.
[0035] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 조사하는 방사선은 베타선을 사용할수 있다.
[0036] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 해캄에 조사하는 방사선은 전자선을 사용할수 있다.
[0037] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 방사선 조사 후 생존한 해캄을 배양하는 배지는 Modified Bold's Basal Medium(MBBM)을 사용할 수 있다.
[0038] 상기의 Modified Bold's Basal Medium(MBBM)의 1리터(liter)의 조성은 NaNO3 0.2465g, CaCl2?2H2O 0.0249g,MgSO4?7H2O 0.07395g, K2HPO4 0.07490g, KH2PO4 0.175g, NaCl 0.02513g, C10H16N2O8(EDTA) 0.04968g, KOH30.86mg, FeSO4?7H2O 4.98mg, H2SO4 0.98 mg, H3BO3 11.13mg, ZnSO4?7H2O 8.83mg, MnCl2?4H2O 1.44mg, MoO36.06mg, CuSO4?5H2O 1.57mg, Co(NO3)2?6H2O 0.49mg, Na2MoO42H2O 1.19mg과 같다.
[0039] 상기에서 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조시 방사선 조사 후 생존한 해캄을 배지에서 배양하는 배양조건은 방사선 조사 후 생존한 해캄을 MBBM 배지에 넣은 다음 Plant culture dish(100×40mm)에100mL의 부피로 넣고 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12:12 Light:Dark cycle, 온도 25℃를 유지하며 배양한 후4일마다 계대 배양할 수 있다.
[0040] 본 발명의 해캄에 방사선을 조사하여 얻은 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 및 이의 제조방법에대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 해캄8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 및 이의 제조방법을 제공하는 것이 바람직하다.본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 [0041] 비해 산화적 환경에 대한 저항성이우수하여 항산화 특성이 또한 우수한 것으로 사료되므로, 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC11713BP)을 재료로 하여 항산화 특성이 우수한 추출물을 얻을 수 있다.
[0042] 본 발명은 항산화 추출물의 추출방법에 있어서, 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을주재료로 하여 항산화 특성이 우수한 추출물을 얻을 수 있다.
[0043] 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 성장속도가 빨라 동일한 조건으로 보통의 해캄을 얻는 것보다 다량의 해캄을 얻을 수 있어 이러한 해캄을 수중 생태계에 첨가하여 수중 생태계의 오염을 방지할 수 있다.
[0044] 본 발명은 해캄의 배양방법에 있어서, 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)으로부터 다량의 해캄을 얻을 수 있다.
[0045] 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 전분의 함량이 많아 보통의해캄으로부터 얻는 전분에 비해 다량의 전분을 얻을 수 있다.
[0046] 본 발명은 전분의 추출방법에 있어서, 본 발명의 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)을 주재료로하여 다량의 전분을 얻을 수 있다.
[0047] 이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[0048] <실시예> 방사선 조사에 의한 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP) 제조
[0049] 해캄은 공주대학교로부터 분양 받아 사용하였다. 실험 해캄의 배양은 Modified Bold's Basal Medium(MBBM)을 사용하였으며, MBBM 배지 1리터(liter)의 조성은 NaNO3 0.2465g, CaCl2?2H2O 0.0249g, MgSO4?7H2O 0.07395g,K2HPO4 0.07490g, KH2PO4 0.175g, NaCl 0.02513g, C10H16N2O8(EDTA) 0.04968g, KOH 30.86mg, FeSO4?7H2O 4.98mg,H2SO4 0.98 mg, H3BO3 11.13mg, ZnSO4?7H2O 8.83mg, MnCl2?4H2O 1.44mg, MoO3 6.06mg, CuSO4?5H2O 1.57mg,Co(NO3)2?6H2O 0.49mg, Na2MoO42H2O 1.19mg과 같다.
[0050] 해캄을 MBBM 배지에 넣은 다음 Plant culture dish(100×40mm)에 100mL의 부피로 넣고 광도 >20 μmol photonm-2s-1, 12:12 Light:Dark cycle, 온도 25℃를 유지하며 배양한 후 4일마다 계대 배양하였다.
[0051] 감마선 조사 실험은 배양중인 해캄을 코발트-60 조사장치(point source, AECL, IR-79, Nordion, Canada)를 이용하여 각각 0kGy, 1kGy 2kGy, 4kGy, 6kGy, 8kGy, 10kGy의 흡수선량으로 조사하였다. 방산선의 선량측정(Dosimetry)은 알라닌 도시메터(alanine dosimeters, Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 이용하여Bruker EMS 104 EPR Analyzer로 분석하였다. 방사선 조사된 각각의 시료는 새로운 MBBM 배지에 옮겨 상기에서
해캄을 MBBM 배지에서 배양시 언급한 동일한 조건으로 배양하였으며 FDA 염색을 통해 감마선을 조사한 해캄의생존율을 분석하였다.
[0052] 방사선 조사 후 생존한 해캄은 다시 새로운 MBBM 배지에 배양하였으며 배양 디시(dish)의 양을 증가시키면서 실험을 위한 돌연변이 seed를 확보하였다.
[0053] 방사선 조사 후 생존한 해캄을 MBBM 배지에 배양하여 얻은 해캄 중에서 방사선을 조사하기 전의 해캄(이하 모균주 해캄이라고 약칭함) 보다 높은 선량의 감마선에서 성장이 가능하며 모균주 해캄 보다 성장 속도가 빠른 해캄을 선별하여 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)로 명명하였으며, 2010년 6월 21일 한국생명공학원내 생명자원관리본부(KCTC)에 KCTC 11713BP의 기탁번호로 기탁하였다.
<시험예 1> 해캄 8GY와 [0054] 모균주 해캄의 성장속도 비교
[0055] 모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 생장률 비교는 배양 중이던 각각의 모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC11713BP)를 동일한 무게(초기 wet weight 0.025±0.06mg)로 맞추어 준 후 100mL MBBM 배지가 들어있는 Plantculture dish에 넣고 광도 >20 μmol photon m-2s-1, 12:12 Light:Dark cycle, 온도 25℃를 유지하며 4주간 배양한 다음 이들에 대한 생장률을 측정하여 그 결과는 도 1에 나타내었다. 이때 생장기간 중 MBBM 배지는 4일에
1번씩 새롭게 갈아주었으며 생장률의 비교는 3회 반복을 통해 평균값과 표준오차 값을 나타내었다.
[0056] 도 1에서처럼 모균주 해캄(a)과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)(b)의 생장률을 비교해 보았을 때 배양 초기(0-1)에는비슷한 생장 패턴을 보이지만 2주부터 생장률의 차이를 확인할 수 있었다. 배양 후 4주째에는 생장률이 해캄8GY(KCTC 11713BP)(b)이 평균 1.5±0.06mg으로서 모균주 해캄(a)의 평균 1.09±0.07mg 보다 약 1.5배 높은 것으로 나타났다.
[0057] 이러한 결과로부터 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 성장속도가 우수함을 알 수있었다.
[0058] <시험예 2> 해캄 8GY와 모균주 해캄의 전분 함량 비교
[0059] 해캄은 다른 조류에 비해 전분(33-64%)을 많이 함유하고 있는 것으로 알려졌으며, 이러한 전분은 요오드(Iodine) 염색을 통하여 확인 할 수 있으며 이를 이용하여 모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 전분 함량의 차이를 확인해 보았다.
[0060] 요오드(Iodine) 염색은 각각의 모균주 해캄 및 해캄 8GY(KCTC 11713BP) 시료 0.3g을 5배 볼륨(volume)의 100%에탄올(Ethanol)을 첨가한 후 상온에서 20분간 3회 반복 인큐베이션(incubation)하여 모균주 해캄 및 해캄8GY(KCTC 11713BP)의 엽록체의 색소를 제거하였다. 색소가 제거된 각각의 시료를 요오드 용액(Iodine solution)(Iodine 2mg/mL, potassium iodide 20mg/mL)으로 상온에서 20분간 인큐베이션(incubation) 후 MBBM으로 3회 씻어 준 후 현미경을 통해 관찰하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[0061] 도 2에서처럼 각각의 시료에 축적된 전분은 모균주 해캄(a)과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)(b)에서 많은 것으로 관찰되었다.
[0062] 이러한 결과로부터 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 전분의 함량이 많음을 알 수 있었다.
[0063] <시험예 3> 해캄 8GY와 모균주 해캄의 산화적 손상에 대한 저항성 평가
[0064] 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 세포에 처리하는 실험방법은 널리 사용되는 산화성 손상모델로서 여러세포주에서 용량 의존적 세포사가 발생한다.
[0065] H2O2에 의한 해캄의 산화적 손상에 대한 저항성 평가를 측정하였다.
[0066] MBBM에 배양되던 해캄 8GY(KCTC 11713BP)와 모균주 해캄을 24공 평판배양기에 각 웰당 0.1g씩 분주하고 H2O2의농도를 0mM, 0.04mM, 0.08mM, 0.16mM, 0.31mM, 0.63mM, 1.25mM, 2.5mM, 5mM 및 10mM이 되도록 MBBM로 용량 의존적으로 희석하여 각각 5mL씩 첨가하여 7일간 배양한 후 세포사를 측정하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[0067] 도 3에서처럼 H2O2 용량 의존적 처리에 의한 산화적 손상에 대한 저항성은 모균주 해캄이 H2O2 1.25mM 이상에서모두 세포사하는 것을 나타낸 반면 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 경우 H2O2 5mM까지 생존하는 것으로, 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 산화적 손상에 대한 저항성이 모균주 해캄의 산화적 손상에 대한 저항성 보다 약 4배높은 것으로 나타났다.
[0068] 이러한 결과로부터 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 산화적 손상에 대한 저항성이 우수함을 알 수 있었다.
<시험예 4> 해캄 8GY와 [0069] 모균주 해캄의 항산화 효과 측정
[0070] DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-℃tylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에의한 항산화 활성을 측정한다. 즉, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정함으로서 항산화 활성을 측정하는 방법이다.
[0071] 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)과 모균주 해캄에 대한 항산화 효과를 DPPH법을 이용하여 측정하였다. 이때사용한 시약으로는 DPPH(Aldrich, Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여100mL로 하여 평가하였다.
[0072] 해캄 8GY(KCTC 11713BP)과 모균주 해캄에 대한 항산화 효과 실험방법은 96-공 평판배양기에 0.1mM DPPH 용액0.15ml에 해캄 8GY(KCTC 11713BP) 및 모균주 해캄의 시료용액 0.15ml를 가하여 교반하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 560nm에서 흡광도 St를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작하여 흡광도 Bt를 측정하고, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다. DPPH 억제율은 하기 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1에 나타내었다.
[0073] <수학식 1>
[0074] DPPH 억제율(%) = [{1-(St-So)}/(Bt-Bo)] × 100
[0075] St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560㎚에서의 흡광도
[0076] Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560㎚에서의 흡광도
[0077] So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560㎚에서의 흡광도
[0078] Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560㎚에서의 흡광도
표 1
[0079] DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정
시료명 IC50 (mg/mL)
모균주 해캄 0.256
8GY(KCTC 11713BP) 0.187
[0080] 상기의 표 1의 DPPH법을 이용한 해캄 8GY(KCTC 11713BP) 및 모균주 해캄의 항산화 효과 실험 결과 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 모균주 해캄 보다 약 30%이상 항산화능이 높은 것으로 나타났다.
[0081] 상기의 표 1의 결과로부터 본 발명의 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 항산화 특성이 우수함을 알수 있었다.
[0082] <시험예 5> 해캄 8GY(KCTC 11713BP)와 모균주 해캄의 단백질 발현 비교
[0083] 단백질 발현 분석을 위한 시료인 모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)는 액화질소 안에서 파쇄한 후 5볼륨(volume)의 Lysis 버퍼용액(8M Urea, 4% CHAPS, 40mM DTT, 1mM PMSF, 40mM Tris-HCl)에 용해시켰다. 실온에서30분간 방치한 후 용해되지 않는 물질은 원심분리기로 제거하였다(15,000rpm, 20분, 4℃). 분리된 단백질은TCA(Trichloroacetic acid)를 이용해 침전시킨 후 DTT(Dithiothreitol)가 0.07%로 첨가된 아세톤(acetone)으로 세척(washing)하였다. 단백질 농도는 상업적으로 판매되는 Bradford reagent(Bio-Rad protein assay kit,Bio-Rad, Richmond, USA)를 사용하여 측정하였다.
[0084] 일차원적인 젤 분리는 18cm pH 3-10의 immobilized pH gradient gel(IPG) strip을 가지고 제조회사의 프로토콜(Bio-Rad)대로 시행하였다. 1mg의 단백질을 IPG strip에 놓고 등전하 초점화(isoelectric focusing; IEF)는PROTEAN IEF(isoelectric focusing) cell을 가지고 시행하였다. IEF 후 IPG strip은 2% DTT를 포함하는 6MUrea, 2% SDS, 0.05M Tris-HCl(pH 8.8)와 20% glycerol에서 15분 동안 평형화시킨 뒤 2.5% iodoacetamide를포함하는 같은 용액(2% DTT, 6M Urea, 2% SDS, 0.05M Tris-HCl(pH 8.8), 20% glycerol)에서 15분간 평형화시켰다. 평형화된 IPG strip은 15% uniform polyacrylamide gel로 옮기고 PROTEAN II XL cell tank (30mA)에서 실험을 계속하였다. 젤은 Coomassie Brilliant Blue R250으로 염색하였다. 이미지들은 PDQuest(bio-rad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대조군과 다르게 발현되는 실험군의 단백질 스팟들은 포항공대 단백질분석실에 의뢰하여 질량분석기(ionization-the time of flight mass spectrometry; MALDI-TOF MS)로 분석하였다.모균주 해캄과 해캄 8GY(KCTC 11713BP)의 단백질 발현을 비교한 것을 나타낸 [0085] 도 4a, 도 4b에서처럼 해캄8GY(KCTC 11713BP)에서 14개의 단백질 spot이 낮게 발현되는 것을 확인하였고, 25개의 단백질이 높게 발현되는것을 확인 할 수 있었다.
[0086] 상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
산업상 이용가능성
[0087] 본 발명의 해캄에 방사선을 조사하여 얻은 해캄 8GY(Spirogya varians 8GY)(KCTC 11713BP)는 보통의 해캄에 비해 산화적 환경에 대한 저항성이 강하여 고부가가치의 항산화 추출물을 제공할 수 있으며, 산화적 환경에서 성장이 우수하여 성장속도가 빠르기 때문에 수질 오염이 심각한 환경에서 성장하여 수질오염의 정화 또는 수질오염을 방지할 수 있으며, 전분의 함량이 높아 바이오연료로서 사용될 수 있는 전분을 보통의 해캄에 비해 많이
제공할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
수탁번호
[0088]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC11713BP
수탁일자 : 20100621
도면
도면1
도면2
도면3
도면4a
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