방사선 조사에 의한 알로에 에모딘의 항암 활성 증진 방법 및 방사선이 조사된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

특허청구의 범위
청구항 1
6.25 ~ 200 uM의 알로에 에모딘에 코발트(Co)-60 방사성 동위원소로부터 방출되는 감마선을 10 ~ 150kGy 선량으로 조사하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물에서 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법.
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제 1항의 방법에 의해 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학조성물.
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청구항 9
제 1항의 방법에 의해 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 개선용 식품조성물.
청구항 10
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명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 알로에 에모딘의 항암 활성 증진 방법, 및 상기 방법에 의해 항암 [0001] 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 함유하는 암 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 알로에 에모딘(Aloe emodin, 1.8-디하이드록시-3-하이드록시메틸-9,10-안트라센디온)은 안트라퀴논계 폴리페놀화합물로, 주로 알로에 베라의 젤, 수액, 또는 잎에서 발견된다. 현재 알로에 에모딘의 항균 효과, 항바이러스효과, 급성 간 손상 완화 효과, 항산화 활성 효과 등 다양한 효능에 대해서 보고되었으며(Food Chemistry 2000,70, 437441. 미국특허 US4670265A; CANCER RESEARCH 60, 28002804, June 1, 2000; ), 뿐만 아니라 알로에 에모딘 (1,8-dihydrooxy-3-(hydroxymethyl)-anthraquinone)이 특이적으로 인간 신경외배엽 종양세포의 성장을 억제하고, 동물모델에서 항종양효과를 나타내는 등 항암 효과를 가지는 것으로 알려졌다(Pecere, T., et al. Aloeemodin is a new type of anticancer agent with selective activity against neuroectodermal tumors.Cancer Res., 11: 2000; Pharmacology & Toxicology 2000, 87, 229233). 특히 알로에 에모딘의 항암 활성에 대하여 많은 연구들이 진행되어 왔다(Leukemia Research February 2002, Volume 24, Issue 1, pp 17-22;American Journal of ermatopathology, Volume 27, Issue 9, Pages 831-840, September 2003; Oral OncologyVolume 43, Issue 9, October 2007, Pages 905910). 이러한 여러 가지 효능을 가진 알로에 에모딘은 천연물질이므로, 알로에 에모딘의 항암 활성이 더욱 높아진다면, 부작용이 작고 약효가 뛰어난 항암제로서 활용될 수 있으리라 예상된다.한편, 방사선 조사 기술은 감마선(Co-60 또는 Cs-137), 전자선, X-선 등의

[0003] 방사능 물질이나 방사선 발생장치에서 나오는 에너지 즉, 이온화된 방사선 에너지를 0.01 kGy ~ 200 kGy 조사선량으로 식품에 조사하는 것으로 식품의 발아억제, 숙도지연, 기생충 및 해충구제, 부패 및 병원성 미생물의 살균 등에 이용된다. 또한, 최근에는방사선 조사가 식품살균의 목적 외에도 식품 가공 및 저장 중 발생할 수 있는 나이트로즈아민(Nitrosamine)과바이오제닉아민(Biogenic amine)과 같은 발암성 물질의 구조를 변화시켜 그 독성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려졌다. 또한 방사선 조사를 이용하여 식품의 알레르기 유발물질을 감소시키기 위한 몇몇 연구가 수행되었으며(Seo JH, et al., J Food Prot 67:1463-8, 2004; Lee JW, et al., Radiat Physics Chem 72:645-650, 2005),이외에도 방사선 조사에 의해 특정 물질의 활성의 증가, 특정 물질의 구조 변화 또는 함량을 증가시키는 연구도보고되고 있다(한국특허 제2009-0043706호; 한국특허 제2008-0046311호 등).
[0004] 이에, 본 발명자들은 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키기 위해 예의 노력한 결과, 방사선이 조사된 알로에에모딘이 방사선이 조사되지 않은 알로에 에모딘에 비해 항암 효과가 훨씬 높은 것을 확인하고서 본 발명을 완성하였다.
선행기술문헌
특허문헌
[0005] (특허문헌 0001) 한국공개특허공보 제1995-001676호(공개일: 1995년 07월 20일)
(특허문헌 0002) 한국공개특허공보 제2012-0044583호(공개일: 2012년 05월 08일)
비특허문헌
[0006] (비특허문헌 0001) CANCER RESEARCH 60, 28002804, June 1, 2000
발명의 내용
해결하려는 과제
[0007] 본 발명의 일 목적은 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
[0008] 본 발명의 다른 목적은 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 제공하는 것이다.
[0009] 본 발명의 또 다른 목적은 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
[0010] 상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 방사선을 이용한 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법을 제공한다.
[0011] 또한, 본 발명은 상기 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법에 의해 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 제공한다.
[0012] 또한, 본 발명은 상기 알로에 에모딘의 항암 활성 증진 방법에 의해 항암 활성이 증가된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[0013] 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
[0014] 본 발명의 일 양상은 알로에 에모딘에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
[0015] 상기 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키는 방법에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 전자선, UV, 또는 X선일수 있으며, 바람직하게는 상기 방사선은 감마선일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0016] 또한 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90, 및 세슘(Cs)-137 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출될 수 있으며, 바람직하게는 상기 감마선은 코발트(Co)-60일수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[0017] 본 발명의 알로에 에모딘의 항암 활성을 증진시키기 위해서, 상기 방사선은 10 kGy 선량 이상으로 조사하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서, 방사선을 10 kGy 미만의 선량으로 조사한 경우, 알로에 에모딘의 항암 활성의 증가 효과가 미비하였다. 더욱 바람직하게는 방사선 선량이 10 kGy 이상 150 kGy 이하일 수 있으나,이에 한정되는 것은 아니다. 방사선 선량이 150 kGy을 초과할 경우, 선량 증가에 따른 항암 활성의 상승 효과를거의 볼 수 없었다. 즉, 상기 바람직한 방사선 선량의 수치 범위는 알로에 에모딘의 증진된 항암 효과를 나타낼수 있음을 기준으로 설정하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 방사선이 조사된 알로에 에모딘과 방사선이 조사되지 않은 알로에 에모딘의 위암 세포(AGS)주에 대한 독성을 비교해보았을 때, 알로에 에모딘에 조사된 방사선 선량이 증가할수록 위암 세포주에 높은 독성을 나타냈다. 특히 각 알로에 에모딘을 25 uM 농도 이상으로 처리하였을 때, 방사선이 조사되지 않은 알로에 에모딘에 비해 최소 선량인 10 kGy 선량으로 조사된 알로에 에모딘의 위암 세포에 대한 독성이 약 20% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 또한 암세포가 아닌 일반 세포에방사선이 조사된 알로에 에모딘과 조사되지 않은 알로에 에모딘을 각각 처리하였을 때, 일반 세포의 생존에는거의 차이가 없어, 알로에 에모딘이 미치는 일반 세포의 독성에 대한 방사선 조사에 대한 영향력은 거의 없는것으로 나타났다.(도 1(a)).
[0018] 본 발명의 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 알로에 에모딘에 관한 것이다. 본 발명의 항암 활성 증진 방법은 항암 활성을 증진시키기 위한 알로에 에모딘에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는시중에서 판매하는 분말 형태로 된 알로에 에모딘을 유기 용매에 녹인 다음, 상술한 방법에 따라 방사선을 조사하여 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 제조할 수 있었다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법에 따라 제조된 알로에 에모딘의 암세포에 대한 독성은 조사되지 않은 알로에 에모딘과 확연한 차이를 가졌으며, 방사선 조사 선량에 의존적으로 증가하였다(도 1, 도 2). 이러한 암세포 독성과 관련하여, 방사선 조사된 알로에 에모딘이 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 더욱 유도하는 것으로 나타나, 암세포에 대한 독성이 세포사멸(apoptosis)에 의한 것임을 확인하였다(도 3). 또한 본 발명의 알로에 에모딘의 항암 활성 증진 방법에 따라 제조된 알로에에모딘의 2차 대사산물의 변화를 분석해보았을 때, 방사선이 조사되지 않은 알로에 에모딘에는 확인하기 어려운2차 대사산물들이 방사선 선량에 의존적으로 증가하면서 나타났다(도 4). 이는 방사선 조사가 알로에 에모딘의구조 및 결합 형태를 변화시켜, 알로에 에모딘의 항암 활성에 긍정적인 영향을 주는 것이라 추측된다. 결국 이러한 영향에 따라 본 발명의 알로에 에모딘이 증진된 항암 효과를 가지는 것이라 예상된다.
[0019]
[0020] 본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법에 의해 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 각각의 알로에 에모딘의 암세포에 대한 독성을 시험해본 결과, 방사선 처리되지 않은 알로에 에모딘보다 암세포에 대한 독성이 확실하게 증가하였으며,일반세포에 대한 독성 영향은 거의 차이가 없었다(도 1 내지 도 3 참조). 이에 본 발명의 방사선이 조사된 알로에 에모딘은 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
[0021] 본 발명의 약학 조성물은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 혈액암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양 등의 다양
한 암 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 방사선이 조사되어 [0022] 항암효과가 증진된 알로에 에모딘을 0.0001 내지 50 중량부로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 50 량부로 포함할 수 있다.
[0023] 본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액, 또는주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제; 또는 연고제 등의 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분선용 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 시럽 또는 엘릭서와 같은 경우 복용에 적합한 경구형 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 제조는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다.

[0024] 본 발명에 따른 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 및 희석제등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨,만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨등이 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다.본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함될 수 있다.

[0025] 본 발명의 약학 조성물은 또한 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 항생제, 알킬화제, 항대사제, 호르몬제, 면역학적 제제, 인터페론 제제 및 다른 항암제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 투여하는 것을 추가로 포함할수 있다. 그러나, 본 발명의 의약 용도 및 치료용 약학 조성물은 상기한 것에 한정되는 것은 아니며, 또한 병용될 수 있는 다른 약제들도 상기한 것들에 한정되는 것은 아니다.
[0026] 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어투여할 수도 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 200 mg/kg으로,바람직하게는 0.001 내지 200 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 그러나 유효성분의 실제 투여량은 암 세포의 양,투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[0027] 또한, 본 발명의 약학 조성물이 적용될 수 있는 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 상기 개체에 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
[0028] 본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 알로에 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방사선이 조사된 알로에 에모딘은 더욱 증가된 항암 활성을 가지고있는 바, 건강식품으로 이용되어 암 예방 또는 개선에 도움이 될 수 있다.
[0029] 본 발명의 식품 조성물은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 혈액암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양 등의 다양한 암 질환의 예방 또는 개선에 도움을 줄 수 있다.
[0030] 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘을 유효성분으로 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류,아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며,통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.본 발명의 식품 조성물에 있어서, 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘은 총 식품 [0031] 조성물 기준 15 중량부 이하,바람직하게는 10 중량 부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
[0032] 본 발명의 식품 조성물로서 음료조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g 이다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 알로에 에모딘이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산,보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이며, 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
발명의 효과
[0033] 본 발명의 방사선이 조사된 알로에 에모딘은 일반세포의 독성에 대해서는 방사선이 비조사된 알로에 에모딘과거의 차이가 없는 반면, 암세포에 대해서는 세포 사멸에 의한 독성이 증가하여, 방사선이 조사되지 않은 알로에에모딘에 비해 적은 양으로도 높은 항암 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 방법 및 본 발명의 방법에 따라 항암 활성이 증진된 알로에 에모딘은 항암제, 또는 건강식품 등에 유용하게 활용할 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0034] 도 1은 본 발명의 방사선 조사된 알로에 에모딘과 비조사된 알로에 에모딘의 종양 및 비종양 세포에 대한 독성을 MTT assay를 이용하여 나타낸 그래프이다. (a)는 종양 세포인 MSV BALB 3T3 에 대한 것이며, (b)는 비종양세포인 BASB 3T3에 대한 것이다.도 2는 위암 세포(AGS)주에 대한 본 발명의 방사선 조사된 알로에 에모딘과 비조사된 알로에 에모딘의 독성을비교한 그래프이다.도 3은 방사선이 조사된 알로에 에모딘과 비조사된 알로에 에모딘의 세포 사멸(apoptosis) 유도능력을 FACS 를이용하여 비교한 결과이다.도 4는 방사선 조사 후의 알로에 에모딘의 2차 대사산물의 변화를 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 보여준다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0035] 이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며,여기에서 설명하는 실시예들에 의해 한정되지 않는다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
[0036] <실시예 1> 알로에 에모딘의 방사선 조사
[0037] 알로에 에모딘은 Sigma사에서 구입한 알로에 에모딘을 10 mg/mL의 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 용해시켜 한국원자력연구원 첨단방사선연구소 내에 비치되어 있는 선원 10만 Ci 코발트(cobalt)-60 감마선 조사시설(Point source AECL, MDS Nordion International Co. Ltd., Ottawa, On, Canada)을 이용하여 실온에서 각각10, 30, 50, 70, 100, 150 kGy를 조사하였다.
[0038] <실험예 1> 방사선 조사 및 비조사된 알로에 에모딘의 암세포 독성 평가
방사선 조사 및 비조사된 알로에 에모딘의 항암활성에 관하여 평가하기 위하여 종양 ([0039] MSV BALB 3T3) 및 비종양세포 (BALB 3T3) 및 위암 세포(AGS)주에 관한 암세포 독성에 관하여 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 세포독성의 평가를 위하여 각각의 세포를 96 well plate에 2 × 104cell/ well로 분주한 후, 세포가 완전히 부착하기까지 4시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양시키고 4시간 후 방사선 조사 (10, 30, 50, 70, 100, 150 kGy) 및비조사된 (0 kGy) 알로에 에모딘을 농도별 (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 uM)로 처리하고, 24 시간 동안 CO2인큐베이터에서 배양시켰다. 24 시간 후 세포독성을 관찰하기 위하여 PBS에 5 mg/mL의 농도로 녹여진 MTT 용액을 10 uL씩 각 well에 첨가한 후 1시간 동안 반응 시킨 후 배양 상등액을 모두 제거하고, DMSO 용액 100 uL를첨가하였고, 흡광도를 517 nm에서 관찰하였다. 세포 생존율은 아무것도 처리하지 않은 그룹을 100%로 나타내었을 때 방사선 조사 및 비조사된 알로에 에모딘을 처리한 그룹을 비교하여 나타내었다. 세포 생존율은 하기 식에의해 계산하였다.
[0040] 세포생존율 = (샘플처리구/샘플비처리구) X 100
[0041] 실험결과 도 1 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 방사선이 조사된 알로에 에모딘의 경우 방사선 조사 선량에의존적으로 암세포 독성이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 비종양 세포에서는 암세포 독성이 적게 증가하는 것으로 나타났다. 특히 위암 세포주의 경우, 25 uM 농도 이상처리에서 방사선이 조사된 알로에 에모딘의 암세포독성 증가가 확연하게 나타났으며, 구체적으로 10 kGy 선량의 경우 비조사된 알로에 에모딘에 비해 25 uM 농도이상에서 위암 세포에 대한 독성이 약 20% 이상 증가하였으며, 150 kGy 선량의 경우 50 uM 농도에서 위암 세포의 생존율이 약 20%이하로 떨어졌다.
[0042] <실험예 2> 방사선 조사 및 비조사된 알로에 에모딘의 세포사멸(Apoptosis) 유도능 확인
[0043] 방사선 조사 및 비조사된 알로에 에모딘의 세포독성을 관찰한 결과 세포독성이 방사선 조사선량에 의존적으로증가하는 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 이러한 암세포독성 증가와 관련하여 알로에 에모딘이 유도하는 암세포독성이 세포의 necrosis를 유도 시키는지 apoptosis를 유도시키는지에 관하여 알아보았다. AGS 위암 세포를 6well plate에 5 × 105cell/ well로 분주한 후, 세포가 완전히 부착하기까지 4시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양시키고 4시간 후 암세포독성이 가장 높았던 150 kGy 조사된 알로에 에모딘 및 비조사된 (0 kGy) 알로에 에모딘을 농도별 (12.5, 25, 50, 100 uM)로 처리하고, 12 시간동안 CO2 인큐베이터에서 배양시켰다. 12 시간 후annexin 5 FITC와 PI를 처리하여 염색한 후 Flow cytometry를 이용하여 염색된 세포를 계수하였다.
[0044] 실험결과, 방사선 조사된 에모딘의 처리는 apoptosis 발생시 염색되는 annexin 5 FITC가 비조사된 에모딘의 처리구에 비하여 월등히 증가하는 것을 알 수 있었다(도 3).
[0045] <실험예 3> 방사선 조사 후의 HPLC를 이용한 2차 대사산물의 변화 분석
[0046] Agilient HPLC(agilent Technological, USA)를 사용하여 방사선 조사 후 생성 되는 2차 대사산물의 변화를 분석 하였다. 컬럼은 Capcell PAK C18 UG 120 (4.6mm x 250, 5㎛)를 사용하였고, 이때 컬럼의 온도는 40oC로 조절하였다. 100%의 물(A)과 100%의 아세토나이트릴 용액(B)을 이동상으로 하여 HPLC를 수행하였다. HPLC 조건은표 1에 나타내었으며 50분간 0.5 mL/분의 유속으로 유지하였고 254nm의 파장에서 분석하였다.
표 1
[0047] 이동상 A: 물 B: 아세토나이트릴
추출모드 이동시간 % 이동상 B
10 80
20 85
25 90
30 100
40 50
50 50
[0048] 실험결과, 방사선 비조사된 알로에 에모딘의 경우 17 분때에서 매인 피크가 관찰되었으며, 방사선 조사의 선량이 증가 할수록 18 분에서 20 분 사이의 방사선 조사에 의하여 생성되는 2 차 대사산물들이 증가하는 것으로 관찰되었다(도 4).
하기에 본 발명의 [0049] 조성물을 위한 제제예를 제시한다.
[0050] <제제예 1> 약학적 조성물의 제제
[0051] 1. 정제의 제조
[0052] 본 발명의 알로에 에모딘 20 ㎎
[0053] 유당 100 mg
[0054] 전분 100 mg
[0055] 스테아린산마그네슘 적량
[0056] 통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 혼합성분을 혼합하고 타정하며 정제를 제조한다.
[0057] 2. 캡슐제의 제조
[0058] 본 발명의 알로에 에모딘 10 ㎎
[0059] 결정성 셀룰로오스 3 ㎎
[0060] 락토오스 14.8 ㎎
[0061] 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
[0062] 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
[0063] 3. 주사제의 제조
[0064] 본 발명의 알로에 에모딘 10 ㎎
[0065] 만니톨 180 ㎎
[0066] 주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
[0067] Na2HPO4·12H2O 26 ㎎
[0068] 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
[0069] <제제예 2> 식품 조성물의 제제
[0070] 1. 음료의 제조
[0071] 본 발명의 알로에 에모딘 500 mg
[0072] 액상과당 2 g
[0073] 올리고당 100 g
[0074] 설탕 2 g
[0075] 식염 1 g
[0076] 물 900 ㎖
[0077] 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 87℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ㎖용기에 취득하여 밀봉 멸균한다.
도면
도면1
도면2
도면3
도면4