신규한 살모넬라 엔테리티디스 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물

(56) 선행기술조사문헌
강정무, 강원대학교 대학원,
박사학위논문(2010.02.)*
American Journal of Veterinary
Research,Vol.54, pp.1306-1309(1993.)
KR1020080110594 A
KR100436740 B1
*는 심사관에 의하여 인용된 문헌

특허청구의 범위
청구항 1
살모넬라 엔테리티디스 균주인 S306-HISE(수탁번호: KCTC 11791BP), 49C-NYSE(수탁번호:KCTC 11793BP) 및S352-PJSE(수탁번호: KCTC 11792BP)로 이루어진 군 중 선택된 적어도 하나 이상의 불활화된 균주를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스의 감염증 예방용 백신 조성물.
청구항 2
삭제
청구항 3
제 1항에 있어서, 애주번트로 ISA70을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스의 감염증 예방용 백신 조성물.
청구항 4
제 1항에 있어서, 근육 주사용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스의 감염증 예방용 백신 조성물.
청구항 5
1)살모넬라 엔테리티디스 균주인 S306-HISE(수탁번호: KCTC 11791BP, 49C-NYSE(수탁번호:KCTC 11793BP) 및S352-PJSE(수탁번호: KCTC 11792BP)로 이루어진 군 중 선택된 적어도 하나 이상의 균주를 배양하는 단계; 및2)상기 균주를 불활성화시키는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법.
청구항 6
제 5항에 있어서,단계 (2)에서 포르말린을 처리하여 균주를 불활성화시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 7
제 1항에 따른 백신 조성물을 닭에 투여하여 살모넬라 엔테리티디스의 감염증을 예방하는 방법.
청구항 8
제 7항에 있어서, 상기 백신 조성물내 균 수 함량을 107내지 109cfu로 하여 투여하는 것을 특징으로 하는방법.
청구항 9
제 7항에 있어서,백신 조성물을 근육 주사로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 10
제 7항에 있어서,백신 조성물을 1 또는 2회 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 신규한 살모넬라 엔테리티디스 균주 및 이를 포함하는 백신 [0001] 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 국내의 양계장에서 분리된 신규한 살모넬라 엔테리티디스 균주, 이 균주를 포함하는 백신 조성물, 이백신 조성물의 제조방법, 이 백신 조성물을 가금류에 투여하여 살모넬라 엔테리티디스의 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
전세계적으로 닭, 오리, 칠면조 등 가금과 그 생산물(알, 고기 등)[0002] 을 통한 사람에서의 살모넬라 식중독은 공중 보건학상 매우 심각한 위해로 간주되고 있으며, 축산식품 유래 각종 병원성 세균 가운데 살모넬라는 선두 주자의 위치를 점유하고 있다. 국내 양계사육의 대규모 밀집화에 따른 관련 각 분야에서의 위생 및 방역 소홀로 최근 어린 일령의 닭에서의 살모넬라 엔테리티디스(Samonella Enteritidis, SE)를 비롯하여 숙주 비특이성의 각종 혈청형의 살모넬라에 의한 피해가 급증가하는 추세에 있다.
[0003] SE는 특히 양계산업에서 매우 중요한 문제로 부각되어 있으며, 파아지형 4(Phage type 4, PT4)와 같이전 세계적으로 사람과 가금에서 유행하는 사례가 확인되고 있다. 미국을 비롯한 일부 서구 선진국에서는 이러한 SE를 산란계, 종계 등에서 차단하고자 철저한 관리하에 백신을 도입하여 적용하고 있다. 그런데, 현재 국내산란계에 허가된 SE 관련 백신은 외국제품으로서, 외국의 유행하는 분리균주(예, SE PT4)를 이용하여 제조된 것이며, 국산 백신이 없어 이들의 수입에 의존해야만 하는 실정이다.
발명의 내용
해결하려는 과제
[0004] 이에, 본 발명은 양계농가의 생산성 향상과 공중보건학적으로 안전한 계육 및 계란 생산을 위하여, 닭에서의 SE를 효과적으로 예방하고 수입 백신에의 의존도를 낮추기 위하여 국내 SE 분리주를 이용한 국산 백신을개발하고자 한다.
[0005] 이를 위해, 본 발명자들은 국내 양계산업에서 SE 발생실태를 광범위하게 조사하고, 다양한 SE 분리균주들의 생물학적 특성, 유전자형, 파아지형 및 병원성 등을 분석한 후 이를 통하여 대표 SE 균주 3주를 선발하여불활성화시킨 후에 애주번트(adjuvant)와 혼합하여 SE 사균 백신을 제조하고, 제조된 백신이 고병원성 SE 균주에 대해 유효한 방어효능을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
과제의 해결 수단
[0006] 본 발명의 한 관점은 국내의 양계장에서 분리된 신규한 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, 49CNYSE 및 S352-PJSE에 관한 것이다.
[0007] 본 발명의 다른 관점은 상기 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, 49C NYSE 및 S352-PJSE 중 적어도하나를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
[0008] 본 발명의 또 다른 관점은 (1) 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, 49C NYSE 및 S352-PJSE 중 적어도 하나를 배양하는 단계; (2) 상기 균주를 불활성화시키는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법에 관한것이다.
[0009] 본 발명의 또 다른 관점은 상기 백신 조성물을 가금류에 투여하여 살모넬라 엔테리티디스 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다.
[0010] 이하, 본 발명을 구체적으로 설명하도록 한다.
[0011] 본 발명은 종래의 백신 균주로 사용되어온 살모넬라 엔테리티디스 균주와 파아지형(phage typing) 및유전형이 상이하고, 국내의 양계장에서 분리된 신규한 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, 49C-NYSE, S352-PJSE를 제공한다.본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 균주 중 S306-HISE와 49C-NYSE는 [0012] 상대적으로 높은 폐사율과 실질장기균분리율을 보이며, S352-PJSE는 이 보다는 상대적으로 낮은 병원성을 보인다(실시예 2 참조).이러한 본 발명의 균주를 백신 조성물로 제조하여 접종한 결과, 종래의 백신(109[0013] cfu/수) 보다 낮은 농도(108cfu/수)로 접종되어도 보다 높은 항체가를 나타낸다(실시예 3 및 도 3 참조). 또한, 본 발명의 균주를포함한 백신 조성물은 생체에 안전하고, 종래의 백신 보다 장기간 항체를 지속시키며(실시예 4 및 도 5 참조),우수한 면역원성과 방어능을 발휘할 수 있다(실시예 5 참조).
[0014] 본 발명에 따른 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, S352-PJSE 및 49C-NYSE를 한국생명공학연구원내 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2010년 10월 21일자로 수탁하고, 각각 수탁번호KCTC 11791BP, KCTC 11792BP, KCTC 11793BP를 부여받았다.
[0015] 본 발명에 따른 균주를 포함하는 백신 조성물을 적어도 하나의 애주번트를 포함하는 것이 바람직하다.애주번트(adjuvant)는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다. 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬수 있는 애주번트는 임의의 다양한 애주번트를 포함하며, 전형적인 애주번트로는 프로인트 애주번트((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound),무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A, ISA70에멀전 등이 알려져 있다. 상기 애주번트는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 애주번트로는 ISA 70 에멀전이 바람직하다.
[0016] 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용된 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로로투여된다. 투여 경로는 경구 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여,폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 근육주사, 피하주사, 피내주사 등의방법으로 투여하는 것이다. 특히 바람직한 것은 근육주사 방법으로 투여하는 것이다.
[0017] 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
[0018] 본 발명의 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량"이란 예방효과를 나타낼수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며,백신 접종할 동물의 종류나 연령에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 백신 조성물내 유효 균수 함량은 107내지109cfu, 바람직하게는 108cfu이다.
[0019] 본 발명의 백신 조성물에, 균주는 불활성화 형태로 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 균주는 통상적인 불활성화 방법, 예를 들면, 포르말린과 같은 화합물 처리 또는 열처리 방법으로 불활성화될 수 있으나, 본발명에서는 포르말린 처리가 바람직하다.
[0020] 본 발명의 백신 조성물을 가금류에 투여함으로써 살모넬라 엔테리티디스 감염증을 예방할 수 있다. 상기 가금류에는 닭, 꿩, 오리, 칠면조, 메추라기 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물의 투여 경로는 근육 주사 형태가 바람직하고, 조성물내 균수 함량을 107내지 109cfu/수, 바람직하게는108cfu/수로 하여 접종하고, 이러한 농도의 백신 조성물을 1 또는 2회 투여하는 것이 바람직하다.
발명의 효과
[0021] SE는 어린 닭에서 살모넬라 감염증을 야기하여 경제적 피해를 야기할 뿐 아니라, 주요 식중독균의 하나로서 계육 및 계란 등을 통한 사람의 감염 피해가 공중보건학적인 문제로 대두되어 있다. 따라서, 닭에서의 SE예방을 위한 백신의 개발 및 적용은 산란계 농가를 비롯한 양계농가의 생산성을 향상시키고, 아울러 안전한 계육 및 계란 생산을 통하여 사람에서의 살모넬라 식중독 발생을 차단하는 효과가 기대된다.또한, 현재 국산 SE 백신이 없어 외국 수입백신에 의존하고 있는 상황에서

[0022] 국내 분리 SE 균주에서 유래한 백신균주 및 백신제조법의 확립으로 수입품과 동등하거나 높은 수준의 효능 및 효과를 보이는 국산백신 제조가 가능해져 고가의 수입품 대체 효과를 통하여 경제에 미치는 긍정적 효과가 클 것으로 기대된다.
도면의 간단한 설명
[0023] 도 1은 백신 후보 균주 선발에 이용된 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis, SE) 분리주의유전자형 분석 결과로서, SpeI 제한효소 처리 및 pulse field gel electrophoresis의 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 서로 다른 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물의 접종시 항체가를 나타낸 것이다.
도 3은 백신 조성물의 접종 균 농도에 따른 백신의 항체가를 나타낸 것이다.
도 4는 백신의 안정성을 확인하기 위하여 백신 조성물 접종 후의 증체량을 나타낸 것이다.
도 5. 백신 조성물의 접종 후 시간 경과에 따른 항체가 변화를 나타낸 것이다.
도 6 본 발명에 따른 백신 조성물의 제조 공정을 간략하게 나타낸 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0024] 이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.
[0025] 실시예 1. 국내 양계분야 SE 오염도 및 양계 유래 SE 분리주의 병원성 조사
[0026] 국내 양계산업관련 살모넬라 오염도를 파악하기 위하여, 2002년부터 2003년까지 조사한 양계분야별 살모넬라 분리율을 분석한 바, 조사대상 사료 77점 중 5.2%에서 살모넬라균을 분리할 수 있었으며, 31개 종계장중 38.7%가, 26개 부화장 중 88.5%, 30개 실용계농장 중 70.0% 및 17개 닭도축장 중 94.1%가 살모넬라균에 오염된 것으로 확인되었으며, 이 중 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis, SE)의 오염율이 각각의 양계분야별로 .7-75.0%를 나타내어 가장 높음을 알 수 있었다.
[0027] 국내 양계 유래 SE 80주에 대한 파아지형 분석(phage typing)을 실시한 결과, PT1이 31.3%로 가장 많았으며, PT1, PT4a, PT30 및 PT35가 각각 12.5%, 6.3%, 6.3% 및 6.3%를 나타내었으며, 그러나 조사대상 균주 중40주(50%)는 명확한 반응이 일어나지 않아 파아지형을 결정할 수 없었다.
[0028] 파아지형별 1일령 하이라인 브라운 산란계 병아리에 대한 병원성을 조사하기 위하여 시험군별로 15수의시험계에 약 2~5 x 108cfu/수를 경구로 접종하고 2주후 폐사율, 증체량, 실질장기 균분리율 등을 조사한 바,PT1c 접종구의 폐사율은 33.3% 및 실질장기에서의 균분리율은 86.7-93.3%로 높은 침습성을 나타내었다(표 1).
[0029] 표 1
[0030] 실시예 2. 국내 양계 유래 SE 백신균주 선발 및 병원성 비교
[0031] 높은 병원성을 보인 PT1c 균주 1주와, 파아지형이 결정되지 않은 분리균 군에서 유전자형에 따라 2주의대표 균주를 선발하였다(도 1). 실시예 1에서와 같은 방법으로 1일령 병아리에서 공격접종하여 병원성을 조사하였으며, 그 결과 S306-HISE(53.3%) 및 49C-NYSE(33.3%, PT1c) 등 2주는 높은 폐사율과 실질장기 균분리율을보였으나, 다른 1주 S352-PJSE(6.7%)는 상대적으로 낮은 병원성을 보였다. 이들 3개의 SE 균주를 불활화 백신제조를 위한 후보주로 선발하였다(표 2).
[0032] 표 2
[0033] 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 균주 S306-HISE, S352-PJSE 및 49C-NYSE를 한국생명공학연구원내 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2010년 10월 21일자로 수탁하고, 각각 수탁번호 KCTC11791BP, KCTC 11792BP, KCTC 11793BP를 부여받았다.
[0034] 실시예 3. 국내 양계 유래 SE 분리주를 이용한 백신 제조
[0035] 실시예 2에서 백신 후보주로 선발된 3개의 균주를 20% 글리세롤 함유 TSB(triptic soy broth)에 접종하여 -80℃ 초저온냉동고에 보관하면서 백신제조용 종균으로 사용하였다.
[0036] 백신제조를 위하여 상기한 냉동 백신 후보주를 혈액배지(5% 피브린제거 면양혈액 함유 기본혈액한천배지)에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 갖는 SE 균주를 얻었으며, 이를 TSB에 하룻밤 진탕 배양한 후 균주의 수를 측정하였다.적당하게 배양된 SE 백신균주를 원심 분리하여 세포를 회수하고 0.2% [0037] 포르말린이 함유된 멸균 생리식염수(FPSS)에 부유시킨 후에 원심하고 다시 재부유시키는 과정을 3회 반복한 후에 실온에서 하룻밤 동안 진탕하면서 불활성화시켰다. 상기 백신균주가 불활성화되었음을 확인하기 위해 상기 균주 배양액 일부를 혈액배지에 도말하여 하룻밤 동안 배양하였으며, 상기 균주 배양액에서는 어떠한 콜로니도 형성되지 않았다.
[0038] 불활성화된 백신균주를 수산화알루미늄겔(AI Gel, 근육접종(IM)), Freund's adjuvant(IM), Seppic ISA70(IM 및 피하접종(SC)) 등 다양한 백신 애주번트(adjuvant)별로 면역증강 효능을 시험한 결과, 유상인 SeppicISA 70을 애주번트로 하여 IM시 ELISA를 이용한 혈청검사에서 가장 높은 항체가를 나타내었다(도 2). 따라서이후 불활성화 백신균주를 Seppic ISA 70 오일과 균일하게 혼합한 후 이를 백신으로 사용하였다.또한, 백신내 유효균수 함량을 결정하기 위해 백신내 균수 함량 농도를 106cfu/수 ~ 109
[0039] cfu/수로 접종한 결과, 108cfu/수 접종시 ELISA를 이용한 혈청검사에서 가장 높은 항체가를 나타내어 유효 백신접종 균농도는108cfu/수로 결정하였다(도 3). 피하로 접종하는 수입품인 시판백신(Avac)의 경우 109cfu/수의 농도로 접종하게 되어 있으나, 여기서 제조한 국산백신은 108cfu/수의 농도로 보다 높은 항체가를 나타내었다(도 3).
[0040] 실시예 4. 제조 백신의 안전성 및 면역지속능
[0041] 실시예 3에서 제조된 백신의 안전성을 확인하기 위하여, 6주령 산란계에 각 백신(시판백신 Avac 포함)으로 1차 백신접종을 실시하고, 11주령에 2차 백신접종을 실시하여 증체량을 비교하였다. 백신 1회 접종과 2회접종후 대조군과 유의한 차이를 보이지 않아 안전한 것으로 나타났다(도 4).
[0042] 백신접종 후 항체가는 1회 백신접종 후 3주까지 상승하였으며, 5주 후 2회 백신접종 후 상승하다가 2회백신접종 6주 이후부터 서서히 감소하기 시작하였고, 시판백신과 비교하여 3종의 제조백신 모두 상대적으로 높은 항체 지속능을 보였다(도 5).
[0043] 실시예 5. 제조 백신의 면역원성과 방어능을 실험
[0044] 백신 후보주 별 면역원성과 방어능을 실험하여 가장 높은 효과의 백신을 선정하기 위해 백신접종(본 발명의 백신은 108cfu/수로 접종, A vac은 109cfu/수로 접종)을 6주에 1회, 6주와 11주에 2회, 12주와 17주에 2회 접종을 실시하고, 강병원성 균주(S538-SKSE)를 약 109cfu/수의 농도로 경구를 통하여 공격접종 후 면역원성과 방어능을 조사하였다(표 3).
[0045] 백신접종 3주 후에 공격접종을 실시하여 방어능을 조사한 결과, 공격접종 1주후 총배설강 swab시 균배출 량이 1회 백신 접종시 53~60% 보다 2회 접종시 18~33%로 낮아졌으며, 공격접종 2주후 균분리율이 1회 백신시장기내 80~86%, 맹장내 13~20%으로, 2회 백신시 장기내 50~62%, 맹장내 13~43%으로 2회 백신을 실시할 경우 장기내 균분리율이 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다(표 3).
[0046] 2회 백신 접종 후 공격접종 시기를 3주후와 9주후로 달리하여 공격접종 후 장기내 균분리율을 관찰한결과, 공격접종 1주후 총배설강 swab시 균배출 량이 백신접종 3주후에는 18~33%, 백신접종 9주후는 47~69%로 관찰되었으며, 공격접종 2주후 균분리율이 백신접종 3주후 장기내 50~62%, 맹장내 13~43% 백신접종 9주후 장기내76~87%으로, 맹장내 23~25%으로 관찰되었다(표 3).
[0047] 백신후 공격접종결과 균분리율은 양성 대조군보다 모두 낮았으며, 국내 수입 SE 시판백신과 비교시 항체가와 방어능에서 유의한 차이가 없이 비슷한 결과를 관찰할 수 있었다.
[0048] 표 3
수탁번호
[0049]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC11791BP
수탁일자 : 20101021
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC11792BP
수탁일자 : 20101021
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC11793BP
수탁일자 : 20101021
도면
도면1
도면2
도면3
도면4
도면5
도면6