신규 락토바실러스 루테리 및 이를 포함하는 사료첨가제 조성물

본 발명은 내산성, 내담즙성, 장내부착능, 전분가수분해능이 우수하고, 항생제에 대한 감수성이 있으며, 동물이 섭취했을 때 증체량, 병원성 세균 방어효과 등의 우수한 효과를 나타내는 신규한 락토바실러스 루테리에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 락토바실러스 루테리를 동물용 사료 또는 의약품으로 사용할 경우, 동물의 장내 병원성 세균 억제, 소화증진 및 정장효과를 지속적으로 나타낼 수 있어 축산 농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있고, 뿐만 아니라 이를 활용하여 수입 동물용 의약품을 대체할 수 있다.

특허청구의 범위
청구항 1
서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16s rDNA를 갖고, 내산성, 내담즙성 및 장부착능이 있으며, 전분분해능이있는 것을 특징으로 하는 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91450으로 기탁된 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri).
청구항 2
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청구항 3
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청구항 4
제 1항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 포함하여 이루어지는 사료첨가제 조성물.
청구항 5
제 4항에 있어서, 상기 사료첨가제는 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제 조성물.
명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 신규 락토바실러스 루테리 및 이를 포함하는 사료첨가제 조성물에 [0001] 관한 것으로, 더욱 구체적으로내산성, 내담즙성, 장내부착능, 전분가수분해능이 우수하고, 항생제에 대한 감수성이 있으며, 동물이 섭취했을 때 증체량, 병원성 세균 방어효과 등의 우수한 효과를 나타내는 신규한 락토바실러스 루테리에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 살아있는 미생물인 프로바이오틱스(probiotics)는 장내에서 미생물의 기능을 활성화하여 동물의 건강을 증진한다(Fuller, 1989). 많은 연구자들이 락토바실러스와 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱스(probiotics)가설사 등과 같은 증상을 감소시키거나, 방어한다는 사실을 보고하였다(Gilliland, 1990). 또 다른 프로바이오틱스의 장점은 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮추거나 영양소의 이용률을 높이는데 기여하는 것이다(du Toit etal., 1998; Fukushima et al., 2007; Gilliland, 1990; Lee et al., 2001; Torres-Rodriguez et al., 2007).
[0003] 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)은 가장 많이 연구되고 있는 프로바이오틱스이다(Chang et al., 2001; De Angelis et al., 2006; Geier et al., 2007). 유산균은 대부분동물의 장내에 정상적으로 존재하며 장내 미생물의 균형을 유지하고 숙주의 건강에 유익한 영향을 끼친다. 따라서 장내 유용한 프로바이오틱스를 선정하기위해서는 다음의 몇 가지 중요한 성상을 확인하며 선정한다(Fuller, 1989; Garriga et al., 1998; Martin etal., 2006; Mishra and Prasad, 2005). 즉, 유산균이 소화관 내에서도 생존해야하므로, 내산성이나 내담즙성을 가져야하며, 장에 도달할 때까지 소화관에서 콜로니를 형성해야한다. 또한, 식품이나 사료 또는 임상적으로 사용 시 안전해야하며 동시에 숙주에 유익한 영향을 줄 수 있어야한다. 최근에는 많은 기능적인 특성을 가지고 있는 유산균들이 개발되고 있는데, 그 중 하나는 병원체의 증식을 억제하는 기능(Pascual et al., 1999;Tsai et al., 2005)이나 BSH 활성(Begley et al., 2006; Pereira et al., 2003) 또는 전분 가수분해능(amylolytic activity)(Lee et al., 2001; Vizoso Pinto et al., 2006)을 들 수 있다.
[0004] 이에, 본 발명자들은 상기와 같은 장점을 갖고 사료첨가제로 사용할 수 있는 프로바이오틱스 균주를 찾기위해 예의 연구 노력한 결과, 돼지소장으로부터 신규한 락토바실러스 루테리를 분리하였으며, 분리한 균주가 전분가수분해능, 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 항생제에 감수성을 나타내어 생균제로 사용할 수 있으며, 장내 부착능이 우수하고, 동물이 섭취하였을 때 증체량, 병원성 세균 방어효과 등 우수한 효과를 나타내는 것을확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 내용
해결하려는 과제
따라서 본 발명의 주된 목적은 동물에 유익한 락토바실러스속의 [0005] 미생물을 제공하는데 있다.
[0006] 본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스속 미생물을 포함하며 동물의 장내 병원성 세균 억제, 소화증진및정장효과를 나타내는 사료 및 동물용 의약품을 제공하는데 있다.
과제의 해결 수단
[0007] 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 한국농업미생물자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91450으로 기탁된 락토바실러스 루테리를 제공한다.
[0008] 본 발명 락토바실러스 루테리의 16s rDNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
[0009] 본 발명의 락토바실러스 루테리는 내산성, 내담즙성 및 장부착능이 있는 것을 특징으로 한다.
[0010] 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 락토바실러스 루테리를 포함하여 이루어지는 사료첨가제 조성물을 제공한다.
[0011] 본 발명의 사료첨가제 조성물은 병원성 세균의 체내 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다.
[0012] 이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
[0013] 본 발명은 동물의 건강한 생장을 돕기 위한 목적으로 병원성 미생물에 대한 항균력을 나타내는 새로운 락토바실러스를 동정하고 이를 사료첨가제에 적용한 것이다.
[0014] 본 발명에서는 상기와 같은 유용한 락토바실러스 즉, 프로바이오틱스(probiotics)로 사용할 수 있는 균주를얻기 위하여 건강한 돼지의 소장을 채취하여 이용하였다. 이러한 프로바이오틱스 균주를 얻기 위해서는 바닷물, 토양, 식물, 동물과 같은 자연계의 어떠한 곳에서 채취한 것을 이용하여도 가능하나 가축의 사료첨가물로사용하기 위한 균주의 동정을 위해서는 건강한 동물의 소화기관을 채취하여 이용하는 것이 바람직하다.
[0015] 본 발명에서 목적으로 하는 락토바실러스속 미생물을 분리하기 위해, 우선 세절한 돼지 소장을 MRS 배지에 혼합하여 돼지 소장의 미생물들을 배양한 다음, 탄산칼슘(CaCO3)이 포함된 MRS 고체배지에서 균체의 콜로니(colony)가 형성되도록 배양하였을 때 투명한 환을 생성하는 콜로니를 선별하였다. 이후 선별된 균주를 대상으로 그람염색 및 카탈레이즈(catalase) 활성 실험을 수행하여 그람양성이고 카탈레이즈 음성인 균주를 선별한 결과, 본 발명의 균주인 G8-5 균주를 선별할 수 있었다.
[0016] 선별된 G8-5 균주를 동정하기 위하여, 균주의 DNA를 추출한 다음 16S rRNA에 대한 DNA단편을 PCR을 통해 증폭하였고, 이의 염기서열(서열번호 1의 염기서열)을 분석하여 NCBI의 데이터베이스와 비교하였다. 이의 결과 락토바실러스 루테리와 99%의 상동성을 보이는 것으로 나타났다.
[0017] 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 본 발명의 미생물이 동물의 소화기관을 지나는 동안 생존해 있어야하며, 장내에서 안정적으로 정착할 수 있어야 하고, 동물의 소화기관에 머물면서 동물의 소화를 도울 수 있어야할 뿐만 아니라, 인위적으로 생장이 조절될 수 있어야 하므로 이에 대한 평가를 시도하였다.
[0018] 본 발명 G8-5 균주의 전분가수분해능을 확인한 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 균주의 배양시간에 비례하여
전분의 분해능이 증가하였으며, 전분이 포함되지 않은 MRS 배지보다 1% 전분을 첨가한 배지에서 더 잘 자라는것으로 확인되었다. 또한 1% 전분이 함유된 MRS 배지에서 15시간 배양했을 때 첨가한 전분이 모두 가수분해된것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 균주가 우수한 전분가수분해능을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.
[0019] 동물의 소화기관을 통과하는 동안 미생물이 생존해 있기 위해서는 위산에서의 낮은 pH를 견딜 수 있어야하며, 소화기관에서 분비되는 담즙 또한 견딜 수 있어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 선별된 균주의 내산성및 내담즙성을 조사하였다.본 발명 G8-5 균주의 내산성을 확인한 결과, pH7.2. 3.0, 2.0에서 3시간 배양하였을

[0020] 때 균수가 각각 7.23±0.01, 7.22±0.03, 4.13±0.12(단위 : log CFU/㎖)로 우수한 내산성을 보였고, 0.3% 담즙염을 포함한 배지에서도 잘 자라는 것으로 확인되어 내담즙성 또한 우수한 것으로 나타났다(표 1 및 표 2 참조).
[0021] 항생제 내성 평가를 위해서는 기존에 사용되는 여러 가지 항생제를 디스크를 이용한 방법 또는 배지에 항생제를 첨가하여 이용하는 방법 등으로 균주의 민감도를 확인하여 평가할 수 있다. 본 발명 G8-5 균주의 항생제내성 평가를 실시한 결과, 대부분의 항생제에 대하여 감수성이 있는 것으로 나타나 생균제로의 적용가능성을확인하였다(표 3 참조).
[0022] 장내 부착능의 평가를 위해서는 균주 세포표면의 비극성을 조사할 수 있는데, 이는 일반적으로 비극성율이 높은 균주가 장관의 뮤코스(mucus)나 상피세포에 잘 부착하고, 비극성율과 대장관 상피세포 부착 사이에는 높은상관관계를 갖기 때문이다. 표 4에 나타난 바와 같이 대조균주로 사용한 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis KCTC 3159)는 5.3%로 매우 낮은 비극성을 보인 반면, 본 발명의 G8-5 균주는91.0%로 나타나 우수한 장부착능을 나타낼 것으로 기대된다.
[0023] 상기와 같이 시험관내 실험을 통하여 프로바이오틱스 균주의 유용성을 확인 할 수 있지만, 실제로 동물에 적용하였을 때 효과를 나타낼 수 있는지 확인이 필요하다. 따라서 실제 동물모델을 이용하여 균주를 적용한 다음 이에 따른 동물의 신진대사의 변화를 확인하는 것이 좋다. 이때 동물모델로는 실험을 목적으로 사용할 수있는 어떠한 동물도 사용할 수 있으나 비교적 사육이 간편한 실험용 렛드를 사용하는 것이 좋다.
[0024] 균주의 적용에 따른 동물의 신진대사 변화를 평가하기 위해서는 균주를 음수 또는 사료 등을 통해 동물이섭취하도록 한 다음 증체량의 변화, 혈액 화학치의 변화, 분변 중 미생물 조성, pH 및 수분량의 변화 등을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 동일한 조건으로 병원균을 공격 접종한 다음 상기와 같은 신진대사 변화를관찰함으로써 실제 동물의 건강 유지에 있어서 본 발명 균주의 항균력을 확인할 수 있다.
[0025] 본 발명 G8-5 균주를 섭취하였을 때 렛드의 증체량 변화를 확인한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이 G8-5 투여군의 사료효율이 시판 생균제(양성대조군)와 같이 우수한 것을 확인할 수 있었고, 분변의 미생물에 미치는 영향을 조사한 결과, 8일째와 17일째에 유해미생물인 코리폼(Coliform)이 음성대조군에 비해 다소 감소한 것으로 나타났다(표 6 참조).
[0026] 본 발명 G8-5 균주를 섭취하였을 때 렛드의 혈청중 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO), 총글리세라이드(total glyceride, TG), 빌리루빈(bilirubin, BUN), 고밀도 리포 단백질(high density lipoprotein, HDLD),아밀레아제의 수준을 조사한 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, G8-5 투여군의 혈청중 총콜레스테롤 수치와 빌리루빈 수치가 유의성 있게 감소하였다.
[0027] 살모넬라균주(Salmonella typhimurium)를 공격접종 하였을 때에는, 공격접종 후 11일간 죽거나 임상증상을 보인 랫드는 없었으며, 표 8에서와 같이 G8-5 투여군에서 증체량, 사료섭취량, 사료효율이 유의성 있게 증가하였으며, 사료효율도 우수한 것으로 확인되었다.
[0028] 살모넬라균주의 배설에 미치는 영향을 조사한 결과, 공격접종 1일후에 G8-5 투여군에서 살모넬라의 배설이 유의성 있게 감소하였고, 공격접종 6일째에도 배설되는 살모넬라균주의 수는 대조군과 비교하여 유의성 있게 감소하였다(표 9 참조). 이는 본 발명의 G8-5 균주가 병원성 세균의 체내 증식을 억제한다는 것을 의미한다.
발명의 효과
[0029] 이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 신규한 락토바실러스 루테리를 동물용 사료 또는 의약품으로 사용할 경우,동물의 장내 병원성 세균 억제, 소화증진 및 정장효과를 지속적으로 나타낼 수 있어 축산 농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있고, 뿐만 아니라 이를 활용하여 수입 동물용 의약품을 대체할 수있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명 신규 락토바실러스 루테리의 전분가수분해능 및 균수의 변화를 [0030] 나타낸 그래프이다(A: 기존의MRS 액체 배지, B: 변형된 MRS 액체 배지).
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0031] 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[0032] 실시예 1. 본 발명 균주의 분리 및 동정
[0033] 건강한 돼지의 소장을 1g 정도 채취한 후 멸균 식염수로 세척하고 세절하였으며, 세절된 소장을 MRS 액체배지(100g 당 포도당 2g, 트윈 80 0.1g, 암모늄 시트레이트 0.2g, 초산염 0.5g, 가수황산마그네슘 0.01g, 무수황산망간 0.005g, 2염기 인산칼륨 0.2g, 비프 추출물 1g, 효모 추출물 0.5g, 단백질효소처리 펩톤 1g)에 넣어24시간 배양 하였다. 상기 배양액 0.1㎖을 취하여 0.5% CaCO3가 함유된 MRS 한천배지에 접종한 후 37℃에서48시간 배양하였고, 콜로니 주위에 투명한 환이 생성된 단일 콜로니를 다시 MRS 한천배지에 접종하여 순수 분리하였다.
[0034] 순수 분리한 균주들을 대상으로 그람염색 및 카탈라아제(catalase) 활성을 조사하였고, 그람양성이고 카탈라아제(catalase) 음성인 균주를 선별하였다.
[0035] 상기 순수 분리한 균주의 DNA를 추출하여 PCR을 통해 16S rRNA에 대한 DNA 단편을 증폭하였고, 증폭된 단편의염기서열을 분석하여 NCBI의 데이터베이스와 비교하였다.
[0036] 실시예 2. 전분가수분해능(amylolytic activity) 조사
[0037] 본 발명의 균주(G8-5)를 기존 MRS 액체배지 및 변형(전분 추가)된 MRS(100g 당 전분 1g, 트윈 80 0.1g, 암모늄 시트레이트 0.2g, 초산염 0.5g, 가수황산마그네슘 0.01g, 무수황산망간 0.005g, 2염기 인산칼륨 0.2g, 효모 추출물 0.5g, 단백질효소처리 펩톤 1g) 액체배지에 접종하여 24시간 배양하면서, 각각 3, 6, 8, 12, 24시간이 경과하였을 때 배양액을 취하여 잔여 전분의 양을 측정하였고, 동시에 600㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 도 1에 나타내었다.
[0038] 실시예 3. 내산성 및 내담즙성 조사
[0039] 본 발명의 균주(G8-5)를 MRS 액체배지에서 18시간 배양한 후 원심분리(3000×g, 15분)하여 펠렛을 인산염완충액(pH 7.2)으로 2번 세척하고, 세척된 펠렛 부유액 1㎖에 인산완충액 9㎖를 혼합하여 균수가 7.2×log CFU/㎖인 샘플을 준비하였다. 4N 염산을 사용하여 샘플의 pH를 각각 3.0과 2.0으로 조절하고 3시간 배양한 후 생존율을 확인하였다(표 1 참조). 또한, 담즙염(Difco, 미국) 0.3% 또는 1.0%가 포함된 각각의 MRS 배지에서 24시간 배양한 다음 생존율을 확인하였다(표 2 참조).
표 1
[0040] 균주명 조절된 pH에서 살아남은 균체수(log CFU/㎖)
pH 7.2 pH 3.0 pH 2.0
G8-5 7.23±0.01 7.22±0.03 4.13±0.12
[0041] (평균±표준편차로 표시)
표 2
[0042] 균주명 내담즙성
0.3% 1.0%
G8-5 +++ +++
[0043] (-: 자라지 않음, +: 자람)
[0044] 실시예 4. 항생제 내성 조사
[0045] 시판되는 항생제 감수성 키트(Sensi-Disc , BD Biosciences, Sparks, MD)를 사용하였다.
본 발명의 균주(G8-5)를 배양하고, 완충액으로 현탁하여 108
[0046] CFU/㎖의 균수로 조절한 다음, 조절된 배양액200㎕를 100㎖의 소프트 아가(soft agar)에 넣고 혼합하여 혼합액 15㎖씩을 페트리디쉬(9cm)에 부어 굳혔다.여기에 각각의 항생제를 함유한 종이디스크(paper disk)를 올려 놓고 배양한 후 생성된 억제환을 측정하여 감수성을 확인하였다(표 3 참조).
표 3
[0047] 항생제 G8-5
엠피실린(Ampicillin) S
세팔로틴(Cephalothin) S
페니실린(Penicillin) S
반코마이신(Vancomycin) S
아미카신(Amikacin) I
클로람페니콜(Chloramphenicol) S
에리스로마이신(Erythromycin) S
리팜핀(Rifampin) S
[0048] (S: 감수성(sensitivity), I: 중간감수성)
[0049] 실시예 5. 세포표면의 비극성 조사
[0050] 본 발명의 균주(G8-5)를 MRS 액체배지에서 16 ~ 18시간 배양한 후 원심분리(3000×g, 15분)하고, 펠렛을 두번 세척한 후 식염수에 현탁하여 600㎚의 파장에서 흡광도를 0.5 ~ 0.7로 맞추었다(A0). 상기 현탁액 1.5㎖이들어있는 시험관에 1.5㎖의 헥사데칸(hexadecane)을 가한 후 2분간 격렬하게 혼합하였다. 상기 시험관을 15분간 정치한 후 하층의 수용액층을 멸균피펫을 사용하여 조심스럽게 수집한 다음 600㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다(A1). 측정된 흡광도 결과를 바탕으로 아래의 계산식 1을 이용하여 비극성율을 계산하였다. 대조군으로 락토바실러스 코리니포미스(L. coryniformis KCTC 3159)를 사용하였으며, 상기와 동일한 방법으로 비극성율을 계산하였다(표 4 참조).
[0051] [계산식 1]
[0052] 비극성율(H%) = (1-A1/A0) × 100
표 4
[0053] 균주 비극성율(%)
G8-5 91.0 ± 3.0
L. coryniformis KCTC 3159 5.3 ± 0.
[0054] (평균ㅁ표준편차로 표시)
[0055] 실시예 6. 동물 실험
[0056] 본 발명의 균주(G8-5)를 MRS 배지에서 배양한 후 원심분리(3000×g, 15분)하여 펠렛을 두 번 식염수로 세척하고 깨끗한 식염수에 용해시킨 다음, 균주체수가 5×106CFU/㎖(병원성 세균 실험에서는 5×107CFU/㎖)이 되도록 음수를 제조하여 렛드가 섭취하도록 하였다(실험군).양성대조군으로는 락토바실러스 에시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이([0057] L. casei), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 함유된 시판 생균제(프리마락, 바이엘동물약품)를 사용하였다. 약1g의 시판 생균제를 MRS 액체배지에 접종한 다음 상기 실험군과 동일한 방법으로 준비하였고, 음성대조군으로는 깨끗한 증류수를 사용하여 렛드가 섭취하도록 하였다.
[0058] 6-1. 증체량 조사
[0059] 실험 시작일과 17일째에 각 렛드의 체중, 사료섭취량, 음수섭취량을 측정하였으며, 사료섭취량을 증체량으로나누어 사료효율을 계산하였다(표 5 참조).
표 5
[0060] 증체량(g/d) 사료섭취량(g/d)
사료효율 음수섭취량(㎖/d)
음성대조군 9.04±0.31 22.30±0.62 2.47±0.04 36.8±2.7
G8-5 9.11±0.23 21.10±1.80
2.31±0.15
* 34.0±3.7
양성대조군 9.01±0.60 21.36±0.90
2.37±0.06
* 36.6±2.6
[0061] (평균±표준편차로 표시, *: P<0.05)
[0062] 6-2. 분변의 상태 조사
[0063] 실험 8, 17일째에 각 렛드의 신선한 분변을 채취하여 식염수로 10배 희석 및 혼합한 다음 균질액을 만들어 pH를 측정하였고, 수분은 동결 건조하여 측정하였다. 분변을 10배씩 단계별로 희석한 균질액 중 0.1㎖를 균수측정용 배지인 MRS 고체배지, 맥컨키 고체배지(MacConkey agar), 브릴리언트 그린 고체배지(Brilliant Green agar)에서 배양하여 미생물수(락토바실러스, 코리폼)를 측정하였다(표 6 참조).
표 6
[0064]
그룹
8일 17일
LAB Coliform pH 수분 LAB Coliform pH 수분
(log10
CFU/g)
(log10
CFU/g)
(%) (log10
CFU/g)
(log10
CFU/g)
(%)
음성
대조군
9.30±
0.11
7.41±
0.27
6.13±
0.22
50.3±
4.1
9.15±
0.09
7.13±
0.05
5.86±
0.02
45.3±
3.8
G8-5 9.34±
0.17*
7.30±
0.28*
6.09±
0.24*
49.0±
7.6
9.26±
0.13*
6.60±
0.24*
5.78±
0.06*
51.1±
4.5*
양성
대조군
9.45±
0.26*
7.19±
0.43*
6.07±
0.10*
51.3±
5.2
9.30±
0.16*
7.05±
0.24
5.81±
0.05
52.7±
0.5*
[0065] (LAB: 락토바실러스, Coliform: 코리폼)
[0066] (평균±표준편차로 표시, *: P<0.05)
[0067] 6-3. 혈액 화학치 조사
[0068] 실험 17일째에 각 렛드의 혈액을 채취하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 2,000ㅧg에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 총콜레스테롤(TCHO), 총글리세라이드(total glyceride, TG), 빌리루빈(Bilirubin, BUN), 리포프로틴(High density lipoprotein, HDLD) 및 아밀레아제의 수준(enzymatic diagnostic kits 사용, Sigmaco, USA)을 측정하였다(표 7 참조).
표 7
[0069] 그룹 TG TCHO BUN HDLD AMYL
(㎎/㎗) (㎎/㎗) (㎎/㎗) (㎎/㎗) (U/ℓ)
음성대조군 137±29 81±9 15.4±1.1 157±13 2748±132
G8-5 166±40 72±3* 13.1±0.4* 163±12* 2868±134
양성대조군 150±33 78±6* 12.4±2.1* 165±18* 2703±122
(평균±[0070] 표준편차로 표시, *: P<0.05)
[0071] 6-4. 병원성 세균 방어효과 조사
[0072] 병원성 세균으로 사용할 살모넬라균(Salmonella typhimurium D45)을 육계의 설사변에서 분리하였으며, BHI 액체배지(Difco)를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하였고, 균수는 BHI 고형배지에 희석법을 사용하여 3회 이상반복 시험하여 측정하였다.본 발명의 균주를 5일간 섭취시킨 실험군 및 음성대조군에 상기 살모넬라균을 1×1010
[0073] CFU/㎖의 균체수가 되도록 희석한 용액 1㎖을 음수로 공격접종한 다음, 렛드가 죽거나 임상증상을 보이는지 확인하였고, 상기 실시예6-1과 동일한 방법으로 증체량, 사료섭취량, 음수섭취량, 사료효율을 계산하였다(표 8 참조).
표 8
[0074] 그룹 증체량(g/d) 사료섭취량(g/d) 사료효율 음수섭취량 (㎖/d)
G8-5
7.02±0.61*18.64±0.93*2.66±0.16* 51.97±3.86
음성대조군 6.05±0.80 16.65±1.59 2.77±0.29 51.77±11.71
[0075] (평균±표준편차로 표시, *: P<0.05)
[0076] 또한, 공격접종 후 1, 3, 6일째에 분변을 채취하여 링거 용액(ringer solution)에 부유한 다음 브릴리언트 그린 고체배지(brilliant green agar)에서 분변의 살모넬라균수를 측정하였다(표 9 참조).
표 9
[0077] 그룹 접종 후 경과일수
1일 3일 6일
음성대조군 6.92±0.22 6.22±0.25*3/8 ND2/8
G8-5 6.22±0.25* ND ND
[0078] (평균±표준편차로 표시, *: P<0.05)
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