항암 및 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스 균주 및 이의 용도

(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
C12N 1/20 (2006.01) A01N 63/02 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01) C12R 1/38 (2006.01)
(56) 선행기술조사문헌
JP2007222162 A

특허청구의 범위
청구항 1
삭제
청구항 2
항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) SSG5 (KACC 91533P) 균주.
청구항 3
항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) SSG6 (KACC 91534P) 균주.
청구항 4
항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) SSG10 (KACC 91535P) 균주.
청구항 5
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암성은 Egr-1(Early Growth Response-1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 6
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항균성은 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 식중독균(Listeria monocytogenes) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 항균성인 것을 특징으로하는 균주.
청구항 7
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 슈도모나스 코리엔시스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는항암성 미생물 제제.
청구항 8
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 슈도모나스 코리엔시스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는항균성 미생물 제제.
청구항 9
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 슈도모나스 코리엔시스 균주를 저영양 세균배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 항암성 미생물 제제의 제조 방법.
청구항 10
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 슈도모나스 코리엔시스 균주를 저영양 세균배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 항균성 미생물 제제의 제조 방법.
청구항 11
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 슈도모나스 코리엔시스 균주의 유효량을 식물 또는 토양에 살포하는 단계를 포함하는 식물의 항균능을 향상시키는 방법.
명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) [0001] 균주 및 이의 용도에관한 것으로서, 구체적으로는 항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항암성 및 항균성 미생물 제제, 상기 항암성 및 항균성 미생물 제제의 제조 방법, 및 상기 균주를 식물 또는 토양에 처리하여 식물의 항균능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
Egr-1 (Early Growth Response-1)은 EGF, PDGF, FGF 등의 각종 세포 성장인자 [0002] 및 자외선이나 방사선 등과 같은 DNA 손상인자의 자극에 의해 발현되어 세포의 성장, 사멸 및 분화를 조절하는 전사 인자(transcription factor)이다. Egr-1의 발현이 증가되면 세포의 종류와 신호자극의 종류에 따라 세포주기 진행을 억제하는p21, 세포사멸을 유도하는 p53 및 Bax, 손상된 DNA 수복에 관여하는 Gadd45, 세포 성장억제에 관여하는 PTEN등의 다양한 암 억제 유전자 발현이 전사 수준 (transcriptional level)에서 조절되어, 비정상적으로 과도하게 성장하는 세포의 성장이 억제되거나 과다한 DNA 손상을 받은 세포에서 세포사멸이 유도되므로, Egr-1은 궁극적으로 암 발생 과정을 억제하는 암억제 유전자(tumor suppressor)로서 기능을 한다 (Baron et al. 2006 Cancer Gene Ther 13: 115).
[0003] Egr-1의 발현은 많은 종류의 암세포의 성장을 현저하게 감소시키며, 발암성(tumorigenesis)을 저해시킨다고보고되었다 (Calogero et al. 2004 Cancer Cell Int 4: 1). 다양한 암세포에서 Egr-1의 발현이 감소되어 있으며, Egr-1의 발현이 상대적으로 부족하게 되면 암 형성이 촉진될 수 있다 (Huang et al. 1997 Int J Cancer72: 102). 또한, 사람 섬유육종 HT1080 세포와 골육종 SaOS2 세포, 신경교아세포종 U251 세포, 유방암 ZR75-1세포 등에 Egr-1을 과발현시키면 암세포에서의 DNA 합성능이 감소되고 세포성장 속도가 억제되며 (Huang etal. 1995 Cancer Res 55: 5054), 사람 섬유성육종 HT1080 세포에 Egr-1 유전자를 도입시키면 TGFβ1, 피브로넥틴(fibronectin), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) 등의 유전자 발현이 증가되어 암세포 성장이정지되고 전이능이 감소된다 (Liu et al. 1999 J Biol Chem 274: 4400). 카레의 성분인 커큐민은 Egr-1 유전자의 발현을 증가시켜 사람 뇌암세포인 U87MG 세포의 성장을 억제시킨다고 보고되었다 (Choi et al. 2008 Cancer Res 68: 1369-77). 따라서, Egr-1 발현을 유도하는 활성 물질은 암세포 성장을 억제하는 암치료제 개발에 유효하게 활용될 수 있을 것으로 추정된다.
[0004] 자연계에 존재하는 전체 미생물 종들 중, 실제로 분리되어 이용되는 종은 1% 미만이고 나머지 99%에 이르는다양한 미생물들은 인간의 실생활에 이용되지 못하고 있다. 이러한 미생물들을 농업적으로 이용하고자 하는많은 노력이 진행되고 있고, 현재까지 진행된 미생물분리 연구는 고농도 영양조건에서 급속히 증식하는 미생물이 대부분이었는데, 저농도 영양조건하에서 느리게 증식하는 세균이 자연환경 중에 다수 존재한다는 사실이밝혀지면서 담수, 해수 및 토양 등 자연생태계에 분포해 있는 저영양 세균(oligotrophic bacteria)에 대한 연구가 활발히 전개되고 있다 (Kim et al. 2005 Kor J Microbiol 41: 293-299). 이들 저영양성 세균은 분리하기도 어렵고, 설사 분리되었다 하더라도 배양이 잘 되지 않거나 배양중에 소멸되는 경우가 많으므로 분류적 또는 생리적 특성에 대한 연구가 미흡한 실정이다 (Nikitin et al. 1985 FEMS symposium 33: 177-189).
발명의 내용
해결하려는 과제
[0005] 본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 기존의 용이하게 배양되는 미생물 자원으로부터 선발하지 않고, 아직 탐색이 미진한 저영양에서 자라는 미생물 자원을 대상으로 항암성을 보이는 균주 및 병원성 미생물에 대하여 실질적 항균성을 보이는 균주를 선발하여 균 동정 및 계통분류학적 특성을 검토하고, 상기와같이 선발된 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주로부터 새로운 항암제 개발 및 친환경적인미생물 유래 항균제 개발 등에 활용하기 위한 목적으로 수행되었다.
과제의 해결 수단
[0006] 상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주를 제공한다.
[0007] 또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항암성 미생물 제제를 제공한다.
[0008] 또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균성 미생물 제제를 제공한다.
[0009] 또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 항암성 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 항균성 미생물 [0010] 제제의 제조 방법을 제공한다.
[0011] 또한, 본 발명은 상기 균주를 식물 또는 토양에 처리하여 식물의 항균능을 향상시키는 방법을 제공한다.
발명의 효과
[0012] 본 발명의 균주는 균주 자체나 그 생성물을 활용하여 암 발생을 억제하는 항암제 또는 항생제 생산에 활용할수 있으며, 이들 균주로부터 활성 물질을 분리할 경우 뛰어난 항암제 또는 항균제를 찾아내어 이 분야의 연구에 새로운 선도물질을 제공할 수 있다. 또한 상기 균주는 저영양 균주로서 저영양 배지에서 잘 자라는 특성이있으므로, 상기 균주로부터 유효물질의 대량생산 시 기존의 미생물 제재의 생산단가에 비해 획기적으로 낮출수 있으므로 경제성이 뛰어난 항암제 또는 항균제의 개발을 기대할 수 있다.
도면의 간단한 설명
[0013] 도 1은 선발된 균주 배양액이 암 억제 관련 유전자의 발현을 유도, 증가시켜 암 억제 단백질의 생산량을 검증한 그림을 보여준다. NT: 처리하지 않음, LB: LB(Luria-Bertani) 액체배지로 처리, SS: 소수면 48개 개별 균주 배양액이 혼합된 GH-서브그룹 물질은행으로 처리, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate): Egr-1의 positive 대조구.
도 2는 선발된 항암, 항균 균주의 16S rDNA 서열분석에 의한 슈도모나스(Pseudomonas) 종간 유연관계를 조사한 계통수이다.

도 3은 선발균 배양액의 병원성 균, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 경시별 성장 저해도를 바이오스크린 기기로 측정한 그림이다.

도 4는 선발된 균주배양액의 에틸아세테이트 추출액의 지시 세균에 대한 시험관 내 (in vitro) 항균성을 보여준다.좌측: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 가운데: 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 우측: 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus).
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[0014] 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항암 또는 항균 활성을 갖는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 슈도모나스 코리엔시스 SSG5 (KACC91533P), 슈도모나스 코리엔시스 SSG6 (KACC 91534P) 또는 슈도모나스 코리엔시스 SSG10 (KACC 91535P)일 수있다. 상기 균주는 한국의 경작지 토양에서 분리될 수 있으며, 저영양 세균배양액에서 배양될 수 있다. 상기균주는 16S rDNA에 근거하여 작성된 계통수에서 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) KACC10848와하나의 클레이드(clade)에 포함될 수 있으며 (도 2), 세균의 생화학적 분류 및 동정을 위해 상업적으로 생산되는 API 20NE, ID 32GN, API ZYM 키트 실험에서 슈도모나스 코리엔시스 KACC10848과 대부분 일치하는 특성을보일 수 있다 (표 1~3).
[0015] 본 발명에 있어서 상기 항암성은 Egr-1(Early Growth Response-1)의 발현을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에제한되지 않는다. 또한, 상기 항균성은 스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria) 또는바실러스 속(Bacillus)에 대한 항균성일 수 있으며, 구체적으로는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus),식중독 균(Listeria monocytogenes) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 항균성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[0016] 본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 코리엔시스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항암성미생물 제제를 제공한다. 상기 항암성 미생물 제제는 저영양 세균배양액에서 2~4주 배양된 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 3주 배양된 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함할 수 있다.
[0017] 본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 코리엔시스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균성미생물 제제를 제공한다. 상기 항균성 미생물 제제는 저영양 세균배양액에서 배양된 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 미생물 제제에 의해 활성이 억제될 수 있는 균은스타필로코커스 속(Staphylococcus), 리스테리아 속(Listeria) 또는 바실러스 속(Bacillus)에 속하는 균일 수있으며, 구체적으로는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 식중독 균(Listeria monocytogenes) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.상기 미생물 제제는 자체로 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 [0018] 담체와 함께 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 제제 또는 현탁액 등의 다양한 제제로 제형화 할 수 있다. 또한 경구투여 시 약제가 위산에 의해 분해하는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도있다.
[0019] 본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 코리엔시스 균주를 저영양 세균배양액에서 배양하는 단계를 포함하는항암성 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 상기 항암성 미생물 제제의 제조 방법은 저영양 세균배양액에서2~4주 배양하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 3주 배양하는 단계를 포함할수 있다.
[0020] 본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 코리엔시스 균주를 저영양 세균배양액에서 배양하는 단계를 포함하는항균성 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 상기 항균성 미생물 제제의 제조 방법은 저영양 세균배양액에서배양하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
[0021] 본 발명은 또한, 본 발명의 슈도모나스 코리엔시스 균주의 유효량을 식물 또는 토양에 살포하는 단계를 포함하는 식물의 항균능을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 식물의 항균능을 향상시키는 방법으로는 본 발명의균주를 배양한 배양액 또는 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액및 제제에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다. 상기 미생물제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
[0022] 본 발명의 방법에 있어, 상기 균주는 바람직하게는 슈도모나스 코리엔시스 SSG5 (KACC 91533P), 슈도모나스코리엔시스 SSG6 (KACC 91534P) 또는 슈도모나스 코리엔시스 SSG10 (KACC 91535P)일 수 있다.
[0023] 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[0024] <실시예 1: 저영양 미생물 자원 분리, 물질은행 제작>
[0025] 본 발명에서는 항암성, 항균성 세균을 분리하기 위하여 전국의 경작지 토양을 대상으로 하여 시료를 채취하고폴리에틸렌 비닐 백(polyethylene vinyl bag)에 넣은 후 실험실로 운반하였다. 수집된 토양시료 1g에 멸균수9㎖를 넣고 실온에서 30분간 진탕(shaking) 후 10-3과 10-4별로 각각 희석하여 저영양 배지인 R2A 배지에 도말하여, 28℃에서 1주일간 배양하여 성장하는 세균만을 분리하였다. 분리된 저영양 세균은 20% 글리세롤이 첨가된 R2A 배지에 넣어 -70℃에 보관하여 사용하였다. 지역별로 수집된 토양시료를 평판희석법으로 저영양 배지인 R2A 배지에 배양한 결과 총 10,753 개의 균주가 분리되었다. 현실적으로 개개의 클론을 단독 배양하여기능검색을 할 경우 시간이나 경비 측면에서 매우 비효율적이므로 한정된 기간 내에 막대한 수의 클론을 검색하기가 사실상 불가능하다. 이에 본 발명자는 개별 클론을 28℃에서 3일간 진탕 배양하여 원심분리한 배양액을 각 5㎖씩 384개의 클론 배양액을 모두 모아서 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하여 384배 농축한것을 1그룹으로 묶고 ,동시에 각 48개의 클론 배양액 2㎖씩을 모두 모아서 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로추출하여 48배 농축한 8개 서브그룹을 제작하고, 또한 개개의 클론 배양액은 일회용 0.45㎛ 제균 필터로 균을제거하여 각 배양 여액을 1㎖씩 -20℃ 냉동고에 보관하여 항균 클론의 선발 자원으로 사용하였다.
[0026] <실시예 2: 암 억제유전자의 발현 촉진 물질 생산 균주의 스크리닝>
[0027] 상기 384개의 클론을 하나의 그룹으로 하여 상기 검정시스템으로 1차로 선발되면 이 그룹의 8개의 서브그룹을검정하여 2차 선발하고, 최종적으로 각 개별 클론을 검정하는 전략을 사용하였다. 이렇게 분리된 저영양 세균물질을 대상으로 암 억제유전자의 reporter assay와 CCK assay를 실시한 결과 분리된 전체 저영양 세균 중 소수면에서 분리된 균주들을 중심으로 3주의 저영양 세균 배양액에서 항암성 물질이 분비된다는 사실을 최종 확인하였다.
[0028] 최종 선발된 3주의 저영양세균 배양액에 의한 항암성 효과를 검증하기 위하여, 이들 균주들의 배양액을 암세포에 처리한 후 암 억제유전자로 알려진 Egr-1의 유전자 발현이 유도되는지 분석하였다. Egr-1의 발현 정도는Egr-1 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅 법으로 변화되는 Egr-1의 단백질 양을 분석하였다 (도 1). 웨스턴 블롯을실시하기 위하여 5×105개의 사람 대장암세포주인 HCT116 세포 (ATCC사에서 구입)를 60-mm 배양접시에 분주하고 10% 우혈청이 첨가된 DMEM 세포배양액에서 24시간 배양한 후, 각각의 균주 배양액 2㎕를 암세포에 처리하였다. 이때 Egr-1의 발현을 증가시킨다고 알려져 있는 20 nM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 대조군으로 사용하였다. 처리 1시간 후 원심분리하여 세포를 수확하고, 1% Triton X-100, 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤(glycerol)이 함유된 세포용해 완충액으로 4℃에서 30분간 반응시킨 후,15,000X g에서 15분간 원심분리하여 세포질 용액을 추출하였다. 15㎍의 세포질 용액을 8% SDS-폴리아크릴아마이드(SDS-polyacrylamide)에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane)에 전기적으로 부착시킨 후, 5% 탈지 분유에 30분간 반응시켰다. Egr-1을 특이적으로 인지하는 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)를 1㎍/㎖의 농도가 되도록 희석한 후, 단백질이 부착된 니트로셀룰로스막에 각각 첨가하여 상온에서 2시간 이상 반응시켰다. GAPDH 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,USA)는 SDS-PAGE 젤에 첨가한 시료의 단백질 양을 상대적으로 보정하기 위하여 사용하였다. 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20이 함유된 TTBS 완충액으로 10분간 3회 세척 후, 고추냉이 페록시다아제(Horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 anti-rabbit IgG 항체를 가하고 1시간 30분 동안 반응시켰다.TTBS 완충액으로 10분간 5회 세척한 후 ECL (Enhanced Chemiluminescence; Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, NJ, USA) 기질 용액을 1분간 처리한 후 X-선 필름에 노출시켜 세균 배양액에 의해 발현되는 Egr-1 단백질의 양을 분석하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 소수면에서 분리한 G5, G6, G10 세균주 배양액을 처리한 암세포에서 대조군과 비교하여 Egr-1 단백질 발현이 현저하게 증가되어 있음을 최종 확인할 수 있었다.
<실시예 [0029] 3: 선발된 균주의 분류 및 동정>
[0030] 본 발명에서 선발된 균주를 동정하기 위해 분자생물학적 방법과 생화학적 분석을 병행했으며, 최종 확인을 위해서 2003년 본 연구원에서 2003년 신종으로 최초로 보고된 본 발명의 균주 종의 표준균주인 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis)(KACC10848)를 대조구로 사용하였다. 우선 분자생물학적 분류, 동정을 위해 선발균주의 총 DNA를 분리하였으며, 이로부터 16S rDNA 유전자를 증폭하기 위하여 fD1 (5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 1) 및 rP2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3'; 서열번호 2) 프라이머를 이용하여 (Zhu et al. 1993 Nucleic Acids Res 21: 5279-5280) 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 30℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분간, 34 사이클로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5~1.6kb에 해당하는 단편을0.8% 아가로즈겔, 0.5×TAE 버퍼에서 100V로 30분간 전기영동 후 EtBr(ethidium bromide)용액에서 15분간 염색하여 UV램프에서 확인하고 Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen Inc.)로 정제하였다. 분리된 DNA는 사용자설명서에 따라 PCR 2.1 Topo TA Vector system (Invitrogen)에 서브클로닝(subcloning)하였다. 염기서열 분석은 ABI 3700 (Perkin Elmer, Co.) 기기를 이용하였는데, 준비된 클론(clone)을 주형벡터(template vector) 내부에 포함된 M13 정방향, M13 역방향 프라이머를 제작한 뒤, Big Dye 2㎕, 5x 완충액 1㎕, 프라이머(1.6pmol/㎕) 1㎕, 주형 (250~500ng) 6㎕를 PCR 튜브에 넣고 혼합한 후 PCR (ABI 9700)하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 정치 후, 96℃ 10초간 변성(denaturation), 50℃ 5초간 어닐링(annealing), 60℃ 4분간 연장(extension)하는 조건으로 25 사이클을 수행하고, 72℃에서 10분간 추가 연장 후, 4℃에 보관하였다. 상기 반응물 중 10㎕를 1.5㎖ EP 튜브에 옮기고 3M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 7.6) 1㎕와 얼음냉각 한 100%에탄올 25㎕를 넣고 얼음에 20분간 방치 후, 13,000 rpm에서 15분 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 상등액을버리고 70% 냉 에탄올 100㎕로 두 번 세척한 후 상온에서 건조시켰다. 이후 TSR(template suppression reagent) 20~25㎕로 재현탁하여 95℃에서 2분간 반응시키고 얼음에서 식힌 뒤, 자동염기서열분석을 수행하였다. 염기서열의 상동성은 DDBJ/NCBI/GenBank DB의 Blast 프로그램을 이용하여 비교하였으며, 각 염기서열의alignment는 DNA Plus version 3.0 sequence alignment 프로그램 (Scientific and Educational Software)을이용하여 병렬로 정렬하였고, MEGA version 3.0의 근린 결합법(Saitou et al. 1987 Mol Biol Evol 4: 406-425)에 의거하여 저영양 세균의 계통분류학적 위치를 결정하였다 (도 2). 이외에도 세균의 생화학적 분류, 동정을 위해 상업적으로 생산되는 API 20NE, ID 32GN, API ZYM 키트 실험을 수행한 결과 표준균주인 슈도모나스코리엔시스(Pseudomonas koreensis) KACC10848과 대부분 일치하는 결과를 얻었다 (표 1~3). 상기 내용을 종합하면 본 발명의 균주들 (SSG5, SSG6, SSG10)은 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis)임이 확실하므로 이를 국립농업과학원 농용미생물보존센터(KACC)에 2010년 2월 25일자로 기탁하고 기탁번호KACC91533P,KACC91534P, KACC91535P를 부여받았다.

표 1선발 균주의 생리학적, 생화학적 [0031] 특성 시험(API 20NE 키트)
활성성분 KACC 10848 SSG5 SSG6 SSG10
질산칼륨 － － － －
L-트립토판 － － － －
D-포도당 － － － －
L-아르기닌 － ＋ ＋ －
요소 ± ± ± ±
Esculin 구연산철 － － － －
젤라틴(소(bovine) 유래) － ＋ ＋ ＋
p-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 － － － －
D-포도당 ＋ ＋ ＋ ＋
L-아라비노오스 ＋ ＋ ＋ ＋
D-만노오스 ＋ ＋ ＋ ＋
D-만니톨 ＋ ＋ ＋ ＋
N-아세틸-글루코사민 ＋ ＋ ＋ ＋
D-말토오스 － － － －
글루콘산칼륨 ＋ ＋ ＋ ＋
카프르산 ＋ ＋ ＋ ＋
아디프산 － － － －
사과산 ＋ ＋ ＋ ＋
시트르산삼나트륨 ＋ ＋ ＋ ＋
페닐초산 － － － －
표 2
[0032] 선발 균주의 생리학적, 생화학적 특성 시험(ID 32GN 키트)
기질 KACC10848 SSG5 SSG6 SSG10
L-람노오스
N-아세틸 글루코사민 ＋ ＋ ＋ ＋
D-리보오스 ＋ ＋ ＋
이노시톨
D-서당
D-말토오스
이타콘산 ＋
수베린산
말론산 나트륨 ＋ ＋ ＋ ＋
아세트산나트륨 ＋ ＋ ＋ ＋
젖산 ＋ ＋ ＋ ＋
L-알라닌 ＋ ＋ ＋ ＋
5-케토글루콘산염 칼륨
글리코겐
3-하이드록시벤조산
L-세린 ＋ ＋ ＋ ＋
D-만니톨 ＋ ＋ ＋ ＋
D-포도당 ＋ ＋ ＋ ＋
살리신
D-멜리비오스
L-푸코스
D-솔비톨
L-아라비노오스 ＋ ＋ ＋ ＋
프로피온산 ＋ ＋ ＋ ＋
카프르산 ＋ ＋ ＋ ＋
산길초 ＋ ＋ ＋ ＋
시트르산삼나트륨 ＋ ＋ ＋ ＋
L-히스티딘 ＋ ＋ ＋ ＋
2-케토글루콘산칼륨 ＋ ＋ ＋ ＋
3-하이드록시 부티르산 ＋ ＋ ＋ ＋
4-하이드록시 벤조산 ＋ ＋ ＋ ＋
L-프롤린 ＋ ＋ ＋ ＋
표 3
선발 균주의 생화학적 효소 [0033] 특성 분석(API ZYM 키트)
효소 KACC10848 SSG5 SSG6 SSG10
대조구 0 0 0 0
알칼리 포스파타아제 0 1 0 0
에스테라아제(C4) 2 1 2 1
에스테라아제 리파아제 (C8) 3 4 4 3
리파아제 (C14) 0 0 0 0
류신 아릴아미다아제 4 3 4 4
발린 아릴아미다아제 0 0 0 1
시스틴 아릴아미다아제 0 0 0 0
트립신 0 0 0 0
α-키모트립신 0 0 0 0
산성-포스파타아제 3 5 5 5
나프톨-AS-BI-포스포하이드로라아제 2 2 2 2
α-갈락토시다아제 0 0 0 0
β-갈락토시다아제 0 0 0 0
β-글루쿠로니다아제 0 0 0 0
α-글루코시다아제 0 0 0 0
β-글루코시다아제 0 0 0 0
N-아세틸-β-글루코사미니다아제 0 0 0 0
α-만노시다아제 0 0 0 0
α-푸코시다아제 0 0 0 0
[0034] <실시예 4: 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 경시적인 항균 분석>
[0035] 본 발명의 균주의 배양액을 동량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 후 DMSO로 100× 농도가 되도록녹인 후 이를 항균성 검정에 사용하였다. 인체의 병원성 세균인 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)을LB 액체배지에 O.D600=0.1의 농도가 되도록 접종하고, 접종액 195㎕에 추출액 5㎕를 접종하여 37℃에서 진탕배양하며 1시간 30분 간격으로 균주의 O.D600 값을 측정하여 경시적 성장 저해도를 측정하였다 (도 3). 대조구인슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) KACC10848의 추출액을 처리했을 경우도 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 성장이 거의 저해되지 않아 O.D600=1.2 정도까지 잘 자라는 반면, 본 발명의 균주인 SSG5, SSG6, SSG10 균주의 추출액을 처리한 경우 지시병원균의 성장이 현저히 억제됨을 알 수 있었다 (도3).
[0036] <실시예 5: 다양한 세균에 대한 항균성 검정>
[0037] 본 발명의 균주들의 배양액의 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출액의 다른 세균에 대한 항균 스펙트럼을확인하기 위하여, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 식중독 균(Listeria monocytogenes) 및 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis)를 지시균으로 고체배지에 혼합 분주한 뒤, 멸균 디스크에 추출액을 접종하여저해환의 크기를 확인하는 방법으로 항균력 검정을 수행하였다. 도 4에 보이는 바와 같이, 표준균주KACC10848의 추출액에서는 저해환이 거의 관찰되지 않았으나 본 발명의 균주들은 세 지시균 모두에 강력한 항균 활성을 보였다.
수탁번호
[0038]
기탁기관명 : 국립농업과학원 농용미생물보존센터
수탁번호 : KACC91533
수탁일자 : 20100225
기탁기관명 : 국립농업과학원 농용미생물보존센터
수탁번호 : KACC91534
수탁일자 : 20100225
기탁기관명 : 국립농업과학원 농용미생물보존센터
수탁번호 : KACC91535
수탁일자 : 20100225
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