특허권

정향 추출물을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제

상품번호 2019031322595776
IPC 한국(KO) 등록
출원번호 1020000007987
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등록번호 1003311740000
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본 발명은 정향 추출물의 새로운 의학적 용도에 관한 것으로, 구체적으로 정향의 물 추출물, 그 건조 분말 또는 이를 물에 녹인 후 원심분리하여 얻은 수용성 분획을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 정향 추출물은 아직까지 안정성과 유효성이 우수한 치료제가 없는 HBV 감염 치료제 분야에서 탁월한 효과를 나타내며, 독성 또한 기존에 알려진 화합물보다 월등히 낮고, 제조 공정 또한 매우 간단하여 경제적이고 효과적인 B형 간염 바이러스 감염 치료제로 사용될 수 있다.


명세서
도면의 간단한 설명
도 1은 정향의 물 추출물이 HBV DNA의 복제를 저해하는지 확인하기 위하여 각각 64(레인 1), 128(레인 2), 256(레인 3) 및 512(레인 4) ㎍/㎖의 농도로 정향 추출물을 처리고 배양한지 8일 후, HepG2 2.2.15 세포주 배양액을 전기영동하여 3.2 kb의 HBV 유전자 탐침을 이용하여 써던 블럿한 결과를 보여주는 겔 사진이다.
레인 C : 시료를 처리하지 않은 음성 대조군
레인 PC : 10 μM의 ddC를 처리한 양성 대조군
M : 사이즈 마커(λ/Hind Ⅲ)
RC : 원형으로 풀려진(relaxed circular) HBV DNA
발명의 상세한 설명
발명의 목적
발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술
본 발명은 정향 추출물의 새로운 의학적 용도에 관한 것으로, 구체적으로 정향의 물 추출물, 그 건조 분말 또는 이를 물에 녹인 후 원심분리하여 얻은 수용성 분획을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제에 관한 것이다.간염은 간 세포의 염증 또는 급격한 괴사로 간기능이 저하되는 질병으로 발병 원인에 따라 바이러스성 간염, 알콜성 간염, 독성 간염의 3가지로 나뉜다. 간염 바이러스는 30여 종이 알려져 있는데, 이 중 인체에 큰 영향을 미치는 바이러스는 A, B, C, D 및 E형이다. 간염 증상이 6개월 이상 지속되는 만성 간염은 주로 B, C, D형 바이러스에 의한 것으로 급성 간염은 대부분 보존 요법으로 치유될 수 있지만 만성 감염으로 발전된 경우에는 간경변, 간암 등 사망률이 높은 질환으로 이행될 수 있다. 미국이나 유럽 등에서는 알콜성 간염이 많지만 우리나라는 바이러스성 간염이 전체 간질환의 90% 이상을 차지한다. 미국에서만 매년 20만명 정도가 감염되며 우리나라를 포함한 극동지역과 아프리카에서는 전 인구의 최소한 10%가 보균자이고 그 중 많은 숫자가 간암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)으로 진행되는 것으로 알려져 있다 (Tiollas 등,Nature317: 487-495, 1985). 또한 HBV에 감염된 어른의 경우 약 5∼10%만이 간염으로 발전되지만, 신생아의 경우 HBV에 감염된 상태에서는 90%가 발병된다고 보고되어 있다 (Chisari 등,Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A84: 6909-6913, 1989).B형 간염 바이러스는 1964년 미국의 불룸버그에 의해 처음 발견되었으며, 환자의 혈액, 타액, 정액 및 모유 등에 의해전염되는데 우리나라와 같이 대가족 제도를 갖는 동양권에서의 주된 감염 경로는 모체로부터 신생아로의 수직 감염이다. 급성 B형 간염은 대부분이 회복되며 항체가 형성되어 반영구적인 면역 상태가 되지만 약 5∼10%에서 만성화된다.만성 B형 간염의 약 20%는 간경변으로 진행되며 이 중 일부는 간암으로 발전된다.HBV의 구조에 관하여는 많이 알려져 있지만 바이러스 감염에 의한 간세포 손상 및 악성 변질 (malignant transformation)의 병리학적 기전에 관하여는 그리 많이 알려져 있지 않다. 그 이유는 간염 B형 바이러스가 제한된 숙주범위 (host range)를 가지며, 시험관 내 (in vitro)에서의 세포 배양계 (cell culture system)가 확립되지 못해 실험적 접근이 어려웠기 때문이다 (Chisari 등,Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A.84: 6909-6913, 1987). 1990년대 초반 Korba 등은 HBV 유전자를 인간의 간암 세포주 HepG2에 도입 (stable transfection)하여 HBV가 증식되는 HepG2 2.2.15 세포주를 개발하고, 이를 이용한 세포배양 항 HBV 약효검색 시스템을 개발하여 보고한 바 있다 (Korba와 Milman,Antiviral research15: 217-228, 1991; Korba와 Gerin,Antiviral research19: 55-70, 1992). HepG2 2.2.15 세포주는 짧은 시간에 많은 시료를 검색할 수 있어 유용하며 (Jansen,Antimicrob. Agents Chemother. 37: 441-447,1993), 동일한 목적으로 일본에서 개발된 HB 611 세포주보다 배양이 용이하고 바이러스의 수율이 높아 세포 배양판시스템에 적용할 수 있다 (Kruining,J. of Hepatology22: 263, 1995).B형 간염 치료제 또는 백신으로는 α-인터페론, 라미뷰딘 (lamivudin), 재조합 HBV 표면 항원 단백질, 항원-항체 복합체 등이 개발되어 있으나, α-인터페론의 경우 부작용이 많고, 비용이 많이 들며, 치료 기간이 길면서 효과가 적기때문에 그 사용이 차츰 줄고 있다. 그밖에도 전통 약물 중 황기, 감초, 홍삼, 백화사설초, 동충하초, 저령 등이 간염 치료 및 간장질환 치료 보조제로 널리 사용되고 있다.한편, 정향 (Eugenia caryophyllataThunberg)은 정향과 (Myrtaceae)에 속하는 정향나무의 꽃봉오리를 건조한 것으로 예로부터 온중강역, 온신조양의 효능으로서 건위약, 항균약, 항진균약으로서 쓰여왔다. 정향은 어두운 갈색이나 어두운 적색을 나타내고 길이 10 내지 18 mm의 화상과 그 위쪽에 두꺼운 꽃받침 4개 및 4개의 막질화변이 있는데 특이한 냄새가 강하고 맛고 강렬하며 나중에는 혀를 약간 마비시킨다. 유효성분은 정유인 유게놀 (eugenol), 아세틸유게놀(acetyleugenol)등이 알려져 있고, 플라보노이드로서는 람네틴 (rhamnetin), 캠페롤 (kaempferol), 알칼로이드로서는 히게나민 (higenamine)을 함유하고 있다. 이외에도 갈로탄산 (galotanic acid), β-카리오필렌, 2-하이드록시 4,6-다이메톡시 5-메틸아세토페논 등을 함유한다. 정향의 약리작용으로는 상기와 같은 건위, 항균, 항진균 활성 외에도자궁수축, 동물 적출장관 수축, 국소마취에 의한 진통, 아드레날린-길항작용이 있으며, 점막 자극, 거담 작용, 교원질섬유의 생합성 촉진 작용 등이 알려져 있다.구체적으로 정향의 약리효과에 대해 아세틸콜린 에스터라제 (acetylcholine esterase)의 활성 억제 (Akinrimisi 등,West Afr. J. Pharmacol. Drug Res., 1975 2(2): 127-131), 항균 작용 (Ramanoelina 등,Arch. Inst. Pasteur Madagascar,1987, 53(1): 217-226), 글루타치온 S-전이효소 (glutathione S-transferase) 유도를 통한 항암 활성 (Zheng 등,J. Nat. Prod., 1992, 55(7): 999-1003), MMLV (moloney murine leukemia virus)의 역전사효소억제 활성 (Suthienkul 등,Southeast Asian J. Trop. Med, Public Health, 1993, 24(4): 751-755), 항경련 작용(Pourgholami 등,J. Ethnopharmacol., 1999, 64(2): 167-171) 등이 보고되어 있다. 그러나 현재까지 정향의 HBV감염 치료에 대한 효능에 대해서는 알려진 바가 없다.최근 식물 추출물로부터 약리활성을 갖는 조성물을 탐색하려는 노력이 지속되고 있는데, 생약재의 항 HBV 효과에 대한연구 보고는 필란더스 (Phyllanthus) 속 식물인 진주초가 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro)에서 강한 항 HBV 효과가 있으며 (Venkateswaren 등, 1987) 임상에서 유의한 항 HBV 효과를 나타낸다고 보고되면서 (Wang 등,J.Lab. Clin. Med. 126: 350-352, 1995) 제품화를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 최근 105 종의 한국산 생약재들을 대상으로 간염환자의 혈청에서 분리한 HBV DNA 중합효소의 복제 억제도와 표면항원의 결합능을 시험관 내에서 검색한 결과, 15종의 생약재 추출물이 항HBV 효과가 있음이 보고되었다 (Chung 등,Phytotherapy research9:429-434, 1995).이처럼 생약은 한가지의 유효성분 만을 함유하는 것이 아니고, 함유 성분들이 서로 경쟁적으로 (competitive) 작용하는 경우가 대부분이라고 할 수 있다. 이러한 경쟁적 작용으로 인해 각 성분들이 서로 보완 내지 상승 또는 억제의 효과를 나타내게 된다. 따라서 생약은 특정 성분을 분리하는 것 보다 추출물의 형태로 이용해도 무방하다고 할 수 있으며,이렇게 하는 것이 오히여 생약이 가지는 고유한 기능을 효과적으로 발휘하는 것이라 할 수 있다.이에 본 발명자들은 HepG2 2.2.15 배양세포를 사용한 약효 검색 시스템을 이용하여 여러 종류의 천연물을 대상으로항 HBV 활성을 갖는 물질을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 정향의 추출물 또는 추출물의 수용성 분획이 항 HBV 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
본 발명의 목적은 HBV 억제 활성을 갖는 식물 추출물을 제공하는 것이다.구체적으로 본 발명은 식물 추출물로부터 제조되어 제조가 간단하고, 안정성과 유효성이 높으며, 독성이 낮은 B형 간염바이러스 감염 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 구성 및 작용

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정향 (Eugenia cryophyllantaThunberg) 추출물을 유효성분으로 하는 B형간염 치료제를 제공한다.구체적으로 정향 추출물은 정향(丁香)과 (Myrtaceae)에 속하는 정향나무(Eugenia cryophyllantaThunberg)의 꽃봉오리로부터 얻어지는 것으로, 보통 9월에서 다음해 3월 사이에 꽃봉오리가 청색에서 선홍색으로 변할 때 채취하여 화병(花柄)을 햇볕에 말려 추출한 것이다. 본 발명에서 정향 추출물은 물 추출물, 염수 추출물 또는 에탄올과 같은 알콜 추출물들이 모두 이용될 수 있으나, 물 추출물이 특히 HBV 증식 억제 효능면에서 뛰어나다.상기에서 물 추출물은 냉침, 초음파, 환류 중 어느 하나의 방법으로 얻어지는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 건조된 정향 100g 당 1ℓ의 비율로 물을 가하여 100℃에서 2∼3 시간 가열 환류하여 1회만 추출함으로써 정향의 물 추출물을 제조하였다.본 발명의 B형 간염 치료제에서 정향 추출물은 상기에서 제조한 물 추출물을 감압 건조하고 동결건조하여 제조한 건조분말의 형태일 수 있다. 이때 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 제조한 정향 물 추출물의 건조 분말의 수득율은 평균16.7%였다.또한 상기 건조 분말을 물에 녹인 후 원심분리하여 얻어지는 수용성 분획도 본 발명의 B형 간염 치료제의 유효성분으로사용될 수 있다. 이때 원심분리는 건조 분말을 40∼60 ㎎/㎖의 농도, 보다 바람직하게는 51∼52㎎/㎖의 농도로 물에녹이고, 이를 약 10,000g에서 25∼35분간, 바람직하게는 30분간 수행하는 것이 바람직하다. 원심분리한 다음 막 여과기로 멸균하여 상기 HBV 저해 활성을 갖는 정향 추출물의 수용성 분획을 얻을 수 있다. 상기에서 멸균을 위한 막 여과기는 기공의 크기가 약 0.2 마이크로미터인 것이 바람직하다.본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 정향의 물 추출물 건조 분말 51.2 ㎎을 1㎖의 물에 20분간 녹이고, 이를 15℃, 10,000g에서 30분간 원심분리한 다음 상등액을 막 여과기로 멸균한 결과, 전체 용매에 대하여 평균 수득율 74.3%의 수용성 분획을 얻을 수 있었다.이하 본 명세서에서 특별한 한정이 없이 사용되는 '정향의 물 추출물'이라는 단어는 상기에서 언급한 정향의 물 추출물,그 건조 분말 또는 이를 물에 녹여 원심분리하여 얻은 수용성 분획을 모두 의미한다.본 발명에서는 상기 정향의 물 추출물에 대하여 세포 외 HBV DNA 방출 저해여부와 세포 배양액의 HBV 표면 항원의생성 저해 정도를 측정함으로써, 정향 추출물이 갖는 항 HBV 활성을 조사한다.우선, 세포 외 HBV DNA의 방출 정도의 측정을 위한 세포주로는 인간 간암 세포주인 HepG2에 HBV 유전자가 도입된HepG2 2.2.15를 사용하며, RPMI-1640배지에서 배양한 세포주를 세포 배양판에 분주하여 충분히 배양시킨 다음, 정향 추출물을 각각 최종 처리 농도 64, 128, 256, 512 ㎍/㎖가 되도록 처리한다. 구체적으로 정향 추출물이 포함된 세포 배양액 2㎖를 매일 교환하면서 세포에 8일간 처리한다. 상기에서 사용한 HepG2 2.2.15 세포주는 항 HBV 약효 검색을 위해 Korba 등에 의해 개발된 것으로 짧은 시간에 많은 시료를 검색할 수 있고, 배양이 용이하며, 바이러스 수율이 높다는 장점이 있다. 시료의 처리 기간은 HBV DNA 배출이 급격히 증가되어 일정한 량의 바이러스가 지속적으로검출되는 8일간으로 한다.시료 처리 후 8일째 되는 날 세포 배양액을 수거하고 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 용액을 처리하여 비리온을 침전시킨다.이후 프로티나아제 K가 첨가된 분해 용액을 처리하여 세포 외 HBV DNA를 분리한다. 이를 전기영동하고 나일론 막에옮긴 다음 써던 블럿을 통해 HBV DNA를 검출한다. 이때 탐침으로는 공지의 HBV 유전자를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실험예에서는 pHBV315를 제한효소 BamH I으로 절단하여 얻은 3.2 kb 크기의 'adr' 아형 HBV 유전자를 탐침으로이용하였다.본 발명의 실험예에 나타나 있듯이, 써던 블럿 분석 결과 본 발명의 정향 추출물은 128 ㎍/㎖의 농도에서 HBV 증식을현저하게 억제하였으며, 256 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 바이러스 증식을 완전히 억제하여, 양성 대조약물로 사용한 다이데옥시싸이티딘 (ddC)보다 우수한 효과를 보였다. 본 발명의 정향 추출물의 HBV DAN 증식 억제에 대한 EC 50 은 126 ㎍/㎖로 나타났다.또다른 항 HBV 활성 측정 방법으로 방사성 면역 분석법(radioimmunoassay)에 의해 HBs 항원 생성의 저해 정도를조사한다.이를 위해 수거된 세포 배양액을 HBs 항체가 표지된 비드와 혼합하여 반응시킨 후, [ 125 I]로 표지된 HBs 항체 용액과다시 반응시키고 방사능을 측정한다. 실험 결과 정향 추출물은 64∼128 ㎍/㎖에서 HBV 표면 항원 생성 억제도가 30% 이하였으나, 256 ㎍/㎖ 이상에서는 80%에 가까운 억제 효과를 나타내었다.한편, 정향 추출물의 세포 독성 실험 결과, 시료를 512 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 나타나는 세포 독성은 9.3%로 양성 대조약물인 ddC의 10 μM에서 4.4%의 세포 독성과 비교할 때 독성이 매우 적음을 확인할 수 있었다.상기와 같이 본 발명의 정향 추출물은 HBV DNA 복제를 억제하는 효과는 물론 HBV 표면 항원의 생성 억제 효과를 가지며, 세포 독성이 작아 안전성이 높으면서도 효과적인 B형 간염 치료제로 사용될 수 있다.본 발명의 정향 추출물을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 정향 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제,현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.또한 본 발명의 정향 추출물은 기존의 한방 처방에 첨가하여 복합 처방을 함으로써 기존 한방의 약효를 윌등히 증가시킬 수 있다.본 발명의 B형 간염 치료용 약학적 조성물에서 정향 추출물의 유효용량은 10∼2,000 mg/kg 이고, 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 이는 환자의 나이, 성별, 질병의 정도 등에 따라 증감될 수 있다. 본 발명의 정향 추출물은세포 독성 실험에서 양성 대조군으로 사용한 다이데옥시싸이티딘 보다 수십배 더 안전한 것으로 확인되었다.이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 정향 추출물의 제조 1
실험에 사용된 정향은 식품의약품안전청 생약표본 저장고에 보관하여 사용하였다. 세절된 건조 생약 1 ㎏을 사용하여100 g씩 나누어 전자 약탕기에 넣고 물 1 L를 가하여 100℃에서 3 시간 동안 1회만 추출하였다. 각 추출액을 합한 후감압농축시킨 다음 동결건조하여 건조분말 167g을 얻었다.
< 실시예 2 정향 추출물의 제조 2
세절된 건조 생약 1 ㎏을 사용하여 100 g씩 나누어 전자 약탕기에 넣고 물 1 L를 가하여 100℃에서 3 시간 동안 1회만 추출하여 각 추출액을 합한 후 감압농축 시킨 다음 동결건조하여 건조분말 180g을 얻었다.
< 실시예 3 정향 추출물의 제조 3
세절된 건조 생약 1 ㎏을 사용하여 100 g씩 나누어 전자 약탕기에 넣고 물 1 L를 가하여 100℃에서 3 시간 동안 1회만 추출하여 각 추출액을 합한 후 감압농축 시킨 다음 동결건조하여 건조분말 154g을 얻었다.상기한 바와 같이 본원발명에 의한 제조방법에 따라 건조된 정향 1 ㎏을 사용하여 100 g씩 나누어 전자약탕기에 넣고물 1 L를 가하여 100℃에서 2∼3시간동안 1회만 추출하여 각 추출액을 합한 후 감압농축 시킨 다음 동결건조시켜 건조분말로 만든 후 시험물질로 사용하였다. 각각의 수득율은 평균 16.7%이었다.
< 실시예 4 정향 추출물 수용성 분획의 제조 1
실시예 1에서 얻어진 건조분말 51.2 ㎎을 1㎖의 물에 20분간 녹이고 이를 15℃, 10,000 g에서 30분간 원심분리 한후 가용성분인 상등액을 수용성 막 여과기(membrane filter, cut off 0.2㎛)에 여과멸균하여 0.72㎖를 얻었다
< 실시예 5 정향 추출물 수용성 분획의 제조 2
실시예 2에서 얻어진 건조분말 51.2 ㎎를 1㎖의 물에 20분간 녹이고 이를 15℃, 10,000 g에서 30분간 원심분리 한후 가용성분인 상등액을 수용성 막 여과기로 여과멸균하여 0.76㎖를 얻었다
< 실시예 6 정향 추출물 수용성 분획의 제조 3
실시예 3에서 얻어진 건조분말 51.2 ㎎을 1㎖의 물에 20분간 녹이고 이를 15℃, 10,000 g에서 30분간 원심분리 한후 가용성분인 상등액을 수용성 막 여과기로 여과멸균하여 0.75㎖를 얻었다수용성 분획은 건조분말을 40 내지 60 바람직하게는 51 내지 52 ㎎/㎖의 농도로 물에 녹이고 이를 15℃, 10,000 g에서 25 내지 35분간 바람직하게는 30분간 원심분리한 후, 수용성 막 여과기로 여과 멸균하여 얻을 수 있었다. 전체 용매에 대한 수용성 분획의 평균 수득율은 74.3%이었다.
< 실험예 1 정향 추출물의 항 HBV 활성 실험 1
정향 추출물이 HepG2 2.2.15 세포에서 HBV의 증식을 억제하여 세포외로 비리온의 방출을 억제하는 효과를 알아보기위하여 시료를 배양세포에 처리한 후 배양액을 수거하여 HBV DNA를 정량하였다
1) 세포주 확보 및 배양
실험에 사용한 HepG2 2.2.15 세포주는 개발자인 미국의 조지타운 (Georgetown) 대학 의과대학 Korba 교수로부터분양받아 사용하였다. 세포는 도착 즉시 해동하여 5mM HEPES, 5% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 330mg/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 RPMI-1640 (Gibco BRL, 미국) 배지에 넣어 37℃, 5% CO 2배양기에서 배양하였다. 4∼5번의 계대를 거쳐 증식된 세포는 액체질소통에 보관하였으며, 이들을 해동하여 항HBV 효능 검색에 사용하였다.
2) HBV 유전자 탐침
'adr' 아형의 HBV 유전자가 클로닝된 pHBV315를 이화여자대학교 약학대학 김길현 교수로부터 분양받았으며 이 플라스미드를 제한 효소BamHI 으로 절단하고 3.2 kb의 HBV 유전자를 퀴아젠의 겔 용출 키트 (Quiagen gel extractionkit, Hilden, Germany)를 사용하여 분리한 후 써던 블럿 (southern blot) 분석 실험에 탐침 (probe)으로 사용하였다.
3) 추출물의 처리

HepG2 2.2.15 세포주를 이용한 시료들의 항 HBV 효과 검색은 Korba의 방법 (Korba와 Gerin,Antiviral research19: 55-70, 1992)을 기본으로 변형하여 실시하였다.HepG2 2.2.15 세포주를 증식시킨 후 농도를 2×10 5 cells/㎖로 조정하여 24 웰 세포 배양판에 웰 (well) 당 1 ㎖씩분주하였다. 이를 CO2 배양기에서 세포가 충분히 자랄 때까지 배양한 다음 항HBV 효능 검색에 사용하였다. 정향 추출물을 4가지 농도로 희석하여 24 웰 세포 배양판에 20 ㎕/웰 씩 분주한 후 37℃로 예열한 세포 배양액 (2% FBS)을 2㎖씩 첨가하여 각 시료가 100배씩 희석되어 최종 농도가 64, 128, 256, 512 ㎍/㎖가 되도록 하여 처리하였다. 또한 양성 대조 약물인 다이데옥시싸이티딘 (dideoxycytidine, ddC)(Sigma)은 최종농도가 10μM이 되도록 처리하였다. 각시료가 포함된 세포 배양액 2 ㎖를 매일 교환하면서 세포에 8일간 처리하였으며, 세포의 분주와 정향 추출물의 처리는2배수 (duplicate)로 3회 실시하였다.
4) 써던 블럿 분석
시료가 세포 외 비리온 (virion) DNA의 방출을 저해하는 정도를 측정하기 위한 써던 블럿 분석은 김 등의 방법 (Kim등,J. of Applied Pharmacol. 6: 139-144, 1998)에 따라 수행하였다. 시료의 처리 기간은 세포가 충분히 자란 후 HBV DNA 배출이 급격히 증가되어 일정한 양의 바이러스가 지속적으로 검출되는 8일간으로 하였다. 세포에 시료를 처리한 날로부터 8일째 되는 날에 세포 배양액을 수거한 후, PEG 용액을 처리하여 비리온을 침전시키고 프로티나아제 K(Proteinase K)가 첨가된 분해 용액을 처리하여 세포 외 HBV DNA를 분리하였다. 이를 0.8% 아가로즈 겔 (agarose gel)에 전기영동한 후 HBV DNA를 Hybond TM -N+ 나일론 막 여과기 (Amersham, U.K.)로 옮기고 자외선 고정기(Ultraviolet Crosslinker)를 이용하여 고정시켰다. pHBV315를 제한 효소BamHI으로 절단하여 얻은 3.2 kb의 HBV유전자를 탐침으로 사용하여 혼성화 반응 (hybridization)을 수행하였다. 탐침의 표지 및 HBV DNA의 검출은 ECL direct TM 표지 및 검출 키트 (labeling and detection kit, Amersham)를 사용한 써던 블럿 방법으로 수행하였다.그 결과를도 1에 나타내었는데,도 1에서 보는 바와 같이 정향 추출물은 농도 의존적으로 HBV 증식을 억제하였다. 정향(E. caryophyllata)의 수침엑스는 128 ㎍/㎖의 농도에서 현저하게 HBV의 증식을 억제하였고, 256 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 바이러스 증식을 완전히 억제하여 DNA 밴드가 관찰되지 않았으며, 양성대조물인 10μM의 ddC 보다 우수한효과를 보였다. HepG2 2.2.15 세포에서 ddC의 HBV 증식 억제효과는 EC 90 (90% effective concentration)가 6μM로 보고되어 있으며 (Korba 1992), 본 실험에 사용한 ddC의 농도 10 μM은 HBV의 증식을 완전히 억제한 상태를나타내고 있다 (도 1, 레인 PC).상기에서 검출된 HBV DNA 밴드의 양을 데시토미터(densitometer) 및 Bio-Profil 영상 분석 프로그램 (Bio-Profil image analysis program, Vilber Lourmat, France)을 이용하여 측정한 결과, 수침엑스의 HBV DNA 증식 억제에 대한 EC50 는 126 ㎍/㎖ 이하로 나타났다.
< 실험예 2 정향 추출물의 항 HBV 활성 실험 2
1) HBs 항원의 측정
세포에 시료를 처리한 후 8일째 세포 배양액을 수거하여 방사성 면역분석 키트 (radioimmunoassay kit)(Abbott, 미국)를 이용하여 HBs 항원의 양을 측정하였다. 수거된 세포 배양액에 HBs 항체가 표지된 비드 (bead)를 넣고 실온에서20시간 반응시킨 후 비드를 증류수로 세척하고 [125 I] 표지된 HBs 항체용액을 넣어 45℃에서 3시간 반응시켰다. 이비드를 다시 세척한 후 감마-측정기 (gamma counter, PACKARD, 미국)에서 반응정도를 cpm으로 나타낸 후 대조군항원의 양과 비교하여 항원생성 저해능을 측정하였다.
2) 통계처리
실험 결과는 ANOVA (Kruskal-Wallis one way analysis of variance)를 이용하여 통계처리 하였고, 각 군간의 차이를 비교할 경우에는 본페로니의 변형된 t-테스트 (Bonferroni's modified t-test)를 사용하여 p< 0.05 혹은 p<0.01 수준에서 유의성을 검색하였다.HBs 항원 생성의 저해 정도는 방사성 면역 분석법으로 측정하였으며, 저해율은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.
수학식 1
HBs 항원 생성 저해율(%) = [1-(T-B)/(N-B)] ×100
* T : 처리군의 cpm
* N : 비처리군의 cpm
* B : 기본 cpm (background cpm)
시료 처리 후 상기와 같은 방법에 따라 세포 배양액 내의 HBV 항원의 양을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]정향 추출물의 HBs 항원 생성 저해율(%)
처리농도 저해율(%)
정향 추출물 64 (㎍/㎖) 20.5 ±2.6
128 (㎍/㎖) 28.6 ±2.0
256 (㎍/㎖) 77.3 ±1.6
512 (㎍/㎖) 81.4 ±1.7
ddC 10 (μM) 14.4 ±4.1
그 결과, 정향 수침엑스는 전 농도에서 농도 의존적으로 HBV 항원 생성을 억제하였다. 정향 수침엑스는 64∼128 ㎍/㎖에서 HBV의 표면항원 생성 억제도가 30% 이하였으나 256 ㎍/㎖ 이상에서는 80%에 가까운 억제효과를 나타내었다.양성대조약물인 ddC는 14.4%의 낮은 HBs 항원생성 억제도를 나타내었고 이는 Kruining 등(1995)의 보고와 일치하였다. 이는 ddC가 세포질에서 HBV 게놈의 복제는 저해하지만, HBV 전사체 (mRNA)로부터 생성된 HBs 항원이 소포체 (endoplasmic reticulum)의 막에서 HBV 유전자 없이도 항원끼리 자가-조합 (self assembly) 되어 선형 (filament) 및 구형 (sphere)으로 골지체를 거쳐 세포 외로 배출되기 때문에 (Harrison 등,Replication of Hepatitis B Virus, 63-88, 1997) HBV 항원 생성의 억제효과는 미약한 것처럼 나타나는 것으로 보인다.
< 실험예 2 세포 독성 실험
1) 세포 독성 측정 방법
정향 추출물의 세포 독성은 HepG2 2.2.15 세포에 실시예 1의 추출물 또는 실시예 4의 수용성 분획을 세포 배양액에섞어 처리하여 24 시간 동안 배양한 후 시료의 세포 독성에 의해 세포 배양액으로 유리되는 락테이트 탈수소화 효소 (lactate dehydrogenase, LDH)의 양을 LDH 세포 독성 측정 키트 (LDH cytotoxicity kit, Boehringer Mannheim,Germany)를 사용하여 측정하였다 (Shrivastava 등,Cell Biol. Toxicol. 8: 157-170, 1992).
2) 세포 독성 실험 결과
항바이러스 효과를 검색할 시료의 용량을 결정하기 위하여 시료처리 후 세포로부터 배양액 내로 유리된 LDH 활성도를측정하여 세포 독성을 계산하였다. 세포주에 1% Triton X-100을 처리한 것을 LDH 최대 생성량으로 기준하였을 때시료의 최대농도 (512㎍/㎖) 처리로 인해 나타나는 세포 독성은 9.3%로 나타났다. 양성 대조물질로 사용된 ddC를 10μM로 처리하였을 때 세포 독성은 4.4% 이였으며, ddC의 CC 50 (50% cytotoxic concentration)이 168μM인 것과비교하였을 때 본 발명의 정향 (Eugenia caryophyllataThunberg)을 물로 추출한 후 농축 건조시켜 제조된 정향 추출물 또는 이를 물에 녹여 원심분리 한 후 얻은 수용성 분획의 세포 독성은 크지 않은 것으로 나타났다.
< 제조예 1 산제의 제조
대한 약전 제제 총칙 중 산제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1포 중
정향 추출물 (건조분말) 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
탈크 10밀리그램
2) 1포 중
정향의 수용성 분획 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
탈크 10밀리그램
< 제조예 2 정제의 제조
대한 약전 제제 총칙 중 정제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1정 중
정향 추출물 (건조분말) 100 밀리그램
옥수수전분 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 2 밀리그램
2) 1정 중
정향의 수용성 분획 100 밀리그램
옥수수전분 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 2 밀리그램
< 제조예 3 캅셀제의 제조
대한 약전 제제 총칙 중 캅셀제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1캅셀 중
정향 추출물 (건조분말) 100 밀리그램
옥수수전분 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 2 밀리그램
2) 1캅셀 중
정향의 수용성 분획 100 밀리그램
옥수수전분 100 밀리그램
유당 100 밀리그램
스테아린산 마그네슘 2 밀리그램
< 제조예 4 주사제의 제조
대한 약전 제제 총칙 중 주사제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 1 앰플 중 (2 ml)
정향 추출물 (건조분말) 50 밀리그램
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
2) 1 앰플 중 (2 ml)
정향의 수용성 분획 50 밀리그램
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
< 제조예 5 액제의 제조
대한 약전 제제 총칙 중 액제제의 제조방법에 따라 하기의 성분 함량으로 제조한다.
1) 100 ml 중
정향 추출물 (건조분말) 1 그램
이성화당 10그램
만니톨 5그램
정제수 적량
2) 100 ml 중
정향의 수용성 분획 100 밀리그램
이성화당 10그램
만니톨 5그램
정제수 적량
발명의 효과
본 발명에 따라 제조된 정향 (Eugenia caryophyllataThunberg)의 물 추출물, 그 건조 분말 또는 이를 물에 녹여 원심분리 한 후 얻은 수용성 분획은 아직까지 안전성과 유효성이 우수한 치료제가 없는 HBV 치료제 분야에서 탁월한 효과를 나타내며 독성 또한 기존 알려져 있는 화합물보다 월등히 낮아 B형 간염 바이러스 감염의 안전하고 효과적인 치료제로 사용될 수 있다.
(57) 청구의 범위
청구항 1.
정향 (Eugenia caryophyllataThunberg)의 물 추출물 또는 그 건조 분말을 물에 녹여 원심 분리한 후 얻은 수용성 분획을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 2.
제 1항에 있어서, 물 추출물은 냉침, 초음파, 환류 중 어느 하나의 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 3.
제 1항에 있어서, 건조분말은 냉침, 초음파, 환류 중 어느 하나의 방법으로 얻어진 정향의 물 추출물을 감압 농축시킨후 동결건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 4.
제 1항에 있어서, 수용성 분획은 정향의 물 추출물을 40∼60 ㎎/㎖의 농도로 물에 녹이고, 이를 15℃, 1000g에서 약25∼35분간 원심분리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 5.
제 4항에 있어서, 수용성 분획은 정향의 물 추출물을 51∼52 ㎎/㎖의 농도로 물에 녹이고, 이를 15℃, 1000g에서 약30분간 원심분리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 6.
제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
청구항 7.
제 1항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 액제 또는 주사제의 형태로 제제화하여 사용하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
도면
도면 1 

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