rpoB 유전자를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법

본 발명은 rpoB 유전자를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모든 스크렙토마이세스 속 균종의 rpoB 유전자를 증폭시킬 수 있는 특이적 프라이머를 이용하여 감자 더뎅이병과 연관되어 있다고 알려진 표준 균주의 rpoB 유전자를 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하고, 이 데이터베이스로 기존의 형태학적 분류법이 갖는 시간, 정확성의 문제점을 해소하며, 또한 요즘 일반적으로 사용되고 있는 16S rDNA 동정법의 갖는 시간, 비용 상의 문제점을 해결하여 간편하고, 경제적이며 정확성이 높은 감자 더뎅이 병 균종을 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 염기서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종으로 분류하는 방법을 개발함으로써 이 균종의 동정 및 감자더뎅이병 진단에 유용하리라 기대된다.

(30) 우선권주장
1020060117135 2006년11월24일 대한민국(KR)
(56) 선행기술조사문헌
KR100464259 B1
J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 13, No. 6,
pp. 846~852 (2003)
J. Clin. Microbiol., Vol. 37, No. 6, pp.
1714~1720 (1999)
(73) 특허권자
재단법인서울대학교산학협력재단
재단법인 제주하이테크산업진흥원

특허청구의 범위
청구항 1
1) 동정하고자 하는 목적 균주의 rpoB 유전자 분절을, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 목적 균주의rpoB 유전자 분절을 증폭시키는 단계;
2) 상기 증폭된 rpoB 유전자 분절의 염기서열을 분석하는 단계; 및3) 상기에서 분석된 rpoB 유전자 분절의 염기서열과 감자 더뎅이 병과 연관된 표준균주의 서열번호 3 내지 21로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 rpoB 유전자의 염기서열에 대입하여 다정렬한 후 계통도를 완성하여 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법.
청구항 2
청구항 1의 2) 단계에서 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의시그네이쳐(signature) 아미노산 서열을 분석하여 상기 아미노산 서열이 아르기닌(Arg) 또는 세린(Ser)이면 감자더뎅이 병원성 균종을 분류하는 것을 특징으로 하는 감자더뎅이 병원성 균종의 분류방법.
명 세 서
발명의 상세한 설명
기 술 분 야
본 발명은 ｒｐｏＢ 유전자를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법과, [0001] 분석된 rpoB 유전자 염기서열의추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 염기서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종으로 분류하는 방법에 관한 것이다.
배 경 기 술
[0002] 미생물 중에서 스트렙토마이세스 속 균은 그 종(species)이 세균 중에서 가장 다양할 뿐 아니라, 같은 종 내에서도 서로 다른 생리 대사 능력을 보유하고 있다[Anderson AS, Wellington EM. The taxonomy of Streptomyces and related genera. Int J Syst Evol Microbiol. 2001 51(3):797-814]. 따라서, 많은 종류의 생리 활성물질이 방선균의 대사산물로부터 개발되고 있다. 비록 대부분의 스트렙토마이세스 속에 속하는 균종이 식물및 동물에 질병을 유발하지 않으나, 일부는 감자에 더뎅이 병(scab)을 일으킬 수 있다. 이러한 감자 더뎅이병은 감자의 상품성을 현저히 떨어뜨리기 때문에 이 병원균의 정확한 동정은 향후 이 병의 방제 및 농약 개발에중요한 기초를 제공한다는 점에서 중요하다고 할 수 있다.
[0003] 감자에 더뎅이병(scab)을 일으키는 스트렙토마이세스 균종은 주로 세 균주 스트렙토마이세스 스케비에이(S.scabiei), 스트렙토마이세스 에시디스케비에이(S. acidiscabiei) 및 스트렙토마이세스 터지디스케비에이(S.turgidiscabies)에 의해 일어나고 부분적으로는 이 들 균종 이외의 스트렙토마이세스 균종에 의해 일어난다고알려져 있다. 스트렙토마이세스 스케비에이는 이들 균종 중에서 가장 주요한 원인 균으로서 유전적으로 매우 다양한 집단으로 구성되어진 것으로 알려져 있다.
[0004] 스트렙토마이세스 속 균은 세균 중에서 가장 종류가 다양하고 또한 다른 미생물에 비해 상대적으로 발육 속도가느리기 때문에, 생화학적인 방법 혹은 생리학적인 방법으로 균종 분류가 어렵다는 단점을 가지고 있다[Skerman,V. B. D., McGowan, V., Sneath, P. H. A. (ed): Approved Lists of Bacterial Names. Int. J. Syst.Bacteriol. 30:225-420 (1980)]. 따라서, 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정도 여러 미생물학자들에 의해 지방산 분석법, DNA-DNA 부합화법, 및 16S rRNA 유전자 분석법 등의 여러 방법이 연구되어 왔다. 이들 여러방법 중에서 16S rRNA 유전자 분석법은 세균간의 계통학적 관계를 밝히는 데에 있어서 혹은 균종을 동정하는 데에 있어서 탁월한 장점을 보인다고 알려져 있고 이 병원성 균종의 동정에도 역시 가장 널리 이용되고 있다.그러나, 이 방법은 상당히 근접한 균종 간에 있어서 16S rRNA 유전자 염기서열의 보존성으로 인하여 정확한 분류가 상당히 어려운 실정이다. 따라서, 이들 이외에 새로운 대체 유전자를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균의동정 방법의 확립이 필요하다. 최근에 이러한 16S rRNA 유전자 분석법의 단점을 보완하기 위하여 이 유전자에 비해 염기서열 변이가 높은 지역인 16S-23S ITS 부위를 표적으로 하여 균 동정을 수행한 결과가 발표되었으나, 이 방법 역시 표적 유전자가 한 개체 안에 서로 다른 염기서열을 갖는 등 표적 유전자의 문제점으로 인하여감자 더뎅이 병원성 균종의 분류 및 동정에 적합하지 않다는 사실이 알려졌다. 따라서, 감자 더뎅이 병원성균의 정확한 동정을 위해서는 새로운 유전자를 표적으로 하는 새로운 동정법의 개발이 필요한 실정이다.본 연구자들은 groEL2 유전자를 이용하여 감자 더뎅이 병원성 균의 동정방법을 [0005] 특허 등록받은 바 있으나[등록번호 제 563292호], 이들 염기로 전환된 아미노산 서열이 복잡하여 균종 간을 간략하고 단순하게 구분하는 시그네이쳐(signature) 아미노산으로 활용하는 데에 있어서 문제가 있다. 따라서, 본 특허에서는 전의 groEL2유전자보다 염기서열 보존성이 높은 rpoB 유전자를 표적으로 감자더뎅이 병원성 균종을 동정하는 방법을 개발하고자 하였다. 전에도 스트렙토마이세스 속 균종 분류에 이용될 수 있는 새로운 rpoB 비교염기서열 분석방법을 개발하였고 이 방법이 스트렙토마이세스 균종의 동정에 적합하다는 사실을 보여준 바 있으나[김범준 등, IntJ Syst Evol Microbiol. 2004;54: 593-598], 감자 더뎅이 병원성 균종에 해당되는 염기서열에 대한 정보는 구체적으로 언급하지 않았다.
발명의 내용
해결 하고자하는 과제
[0006] 이에, 본 발명자들은 groEL2 유전자를 이용한 기존의 동정법에서 개선되어야 할 균종간 아미노산 서열 보존성이낮은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 모든 스크렙토마이세스 속 균종의 rpoB 유전자를 증폭시킬수 있는 특이적 프라이머를 이용하여 감자 더뎅이병과 연관되어 있다고 알려진 표준 균주의 rpoB 유전자를 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하고, 이 데이터베이스로 기존의 형태학적 분류법이 갖는 시간, 정확성의 문제점을 해소하며, 또한 요즘 일반적으로 사용되고 있는 16S rDNA 동정법의 갖는 시간, 비용 상의 문제점을 해결하여 간편하고, 경제적이며 정확성이 높고, 기존의 groEL2 유전자를 이용한 동정법에 비해 균종간 아미노산 염기서열 보존성이 향상된 감자 더뎅이 병 균종을 동정하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
[0007] 따라서, 본 발명은 특이적 프라이머로 rpoB 유전자를 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하고, 이 데이터베이스로 감자 더뎅이 병원성 균종을 동정하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
[0008] 또한, 본 발명은 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 염기서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종으로 분류하는 방법을 제공하는데 또 다른목적이 있다.
과제 해결수단
[0009] 본 발명은 모든 스트렙토마이세스 속 균종의 rpoB 유전자를 증폭시킬 수 있는 특이적 프라이머로 rpoB 유전자를증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하고, 이 데이터베이스로 감자 더뎅이 병원성 균종을 동정하는 방법을 그 특징으로 한다.
[0010] 또한, 본 발명은 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종을 분류하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.

효 과
[0011] 본 발명에 따른 rpoB 유전자를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균종 동정방법은 기존의 형태학적 분류법이 갖는 시간, 정확성의 문제점을 해소하며, 요즘 일반적으로 사용되고 있는 16S rRNA 동정법의 근접한 균종 간의 정확한분류가 어려운 문제점 및 16S-23S ITS를 표적으로 한 동정방법의 문제점을 해결하여 간편하고, 경제적이며 정확성을 높인 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법으로 향후 이들의 동정에 널리 이용될 수 있다.
[0012] 또한, 본 발명은 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 염기서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종으로 분류하는 방법을 개발함으로써 이 균종의 동정 및 감자더뎅이병 진단에 유용하리라 기대된다.
발명의 실시를 위한 구체적인 내용
이와 같은 본 발명을 더욱 [0013] 상세하게 설명하면 다음과 같다.
[0014] 본 발명은 모든 스트렙토마이세스 속 균종의 rpoB 유전자를 증폭시킬 수 있는 특이적 프라이머를 이용하여 감자더뎅이 병과 연관되어 있다고 알려진 표준 균주의 rpoB 유전자를 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하고, 이 데이터베이스로 감자 더뎅이 병원성 균종을 동정하는 방법과, 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종을 분류하는 방법에 관한 것이다.
[0015] 본 발명에서 사용되는 306 bp의 rpoB 유전자 분절은 RNA 중합효소 서브유니트를 구성하는 아미노산 중에서 여러진성세균(EUBACTERIA) 사이에서 아미노산 및 염기서열이 가장 보존되어 있고 또한 전체 RNA 중합효소 중에서 이효소 기능상에서 가장 중요한 부위로 알려져 있다. 이 부위는 또한 모든 진성세균 사이에서도 아미노산이 보존되어 있는 매우 보존도가 높은 영역 5와 6에 둘러싸여 있다. 이러한 사실로 인하여 본 발명에서 상기 유전자 분절은 세균의 균종 정에 이용될수 있는 분자이다.
[0016] 본 발명은
[0017] 1) 스트렙토마이세스 속 균주의 rpoB 유전자 분절을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 목적 균주의rpoB 유전자 분절을 증폭하는 단계;
[0018] 2) 상기 증폭된 rpoB 유전자 분절의 염기서열을 분석하는 단계; 및
[0019] 3) 상기에서 분석된 염기서열과 감자 더뎅이 병과 연관된 표준 균주의 rpoB 유전자 분절의 염기서열을 비교하는단계를 포함하는 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정방법에 그 특징이 있다.
[0020] 상기 1) 단계에서 rpoB 유전자 분절을 증폭시키기 위하여 스트렙토마이세스 속에 특이적인 프라이머를 제조하는데 있어, 현재 전의 특허[국내 특허 등록 제464260호] 및 논문에서 소개한 전체 스트렙토미세스 속 균종의 352-bp rpoB 유전자 분절을 증폭시킬 수 있는 정방향, 역방향 프라이머를 이용한다. 그 이후에 본 발명에서 분석하고자 하는 감자 더뎅이 병과 연관된 것으로 알려진 표준균주 19종의 DNA를 대상으로 하여 제조된 프라이머
를 이용한 중합효소 연쇄반응이 모든 균종에서 352-bp의 증폭산물을 생산하는지를 확인한다.
[0021] 이때, 바람직한 정방향 프라이머로는 서열번호 1로 표시된 것이고, 역방향 프라이머로는 서열번호 2로 표시되는것이다.
[0022] 상기 스트렙토마이세스 속 균주에 특이적인 프라이머를 이용하여 목적 균주의 rpoB 유전자 분절을 PCR 기법으로증폭하여 염기서열을 분석한다. 이때, 표준 균주의 rpoB 유전자 분절의 데이터베이스는 서열목록상 서열번호 3 내지 서열번호 21로 표시되는 염기서열이다.
[0023] 본 발명에 따른 동정방법에 따라 다음 표 1에 나타낸 표준 균주 19주와 제주도 유래의 감자 더뎅이 병원 조직으로부터 분리된 8주(Jeju PS3, PS4, PS12, H13, H17, H20, H19, H11)를 대상으로 염기서열을 분석하였다.
[0024] [표 1]
[0025] 29 주의 스트렙토미세스 표준 균주 및 본 특허에서 분석한 감자 더뎅이 병원성 19주의 표준 균주 및 8주의 분리균주
[0026]
[0027]이렇게 분석된 염기서열을 다정렬(multialignment)하여 먼저 19주 표준 [0028] 균주의 염기서열을 서로 비교해 본결과, 첫째 감자 더뎅이 병을 유발한다고 알려진 세 균종 스트렙토마이세스 스케비에이, 스트렙토마이세스 에시디스케비에이 및 스트렙토마이세스 터지디스케비에이는 모두 서로 다른 염기서열을 보이면서 계통수에서 서로다른 그룹에 속함을 확인할 수 있었다. 스트렙토마이세스 스케비에이는 서로 밀접한 유전형으로 구성된 다른 병원성균 두 종과는 달리 서로 상당히 다양한 유전형으로 구성되어 있음을 계통수 상에서 확인할 수 있었다.이러한 결과는 이 균종이 서로 다양한 유전형으로 구성되어 있다는 기존의 보고와 일치하는 결과이다.즉, 스트렙토마이세스 스케비에이에 속하는 8주 표준 균주 각각의 306-bp rpoB 염기서열의 상동성을 서로 비교해 본 결과, 92.2 ~ 100% 까지의 매우 넓은 범위의 염기서열 상동성을 보임을 확인할 수 있었다. 염기서열상동성에 기초하여 완성된 계통수에 근거하여 스트렙토마이세스 스케비스는 모두 3개의 그룹으로 구분할 수 있었다. 그룹 I는 스트렙토마이세스 스케비에이 표준 균주인 IFO3111 한 개의 표준 균주를 포함하고, 그룹 Ⅱ는 98%의 염기서열 상동성을 보이는 DSMZ40960, IFO12914의 두 개 표준 균주를 포함하며, 그룹 Ⅲ은 98.4 ~100%의 염기서열 상동성을 보이는 대표 표준균주인 ATCC 49173T를 포함하여 DSMZ 40778, DSMZ 40962,IFO13768, IFO 13767의 다섯 개 표준 균주로 구성됨을 확인할 수 있었다. 스트렙토마이세스 스케비스 표준균주 8주는 높은 종 간 염기서열 다양성(interspecies variation)을 보여주는 반면에 스트렙토마이세스 터지디스케비스에 속하는 표준 균주 4주(ATCC 700248T, IFO 16079, IFO 16080, IFO 16081)는 99.7 ~ 100%의 높은 염기서열 상동성 보임을 확인할 수 있었다.한편, 표준 균주와 목적 균주의 rpoB 염기서열을 분석한 후에 서열 비교하여 [0029] 해당 균주인 것으로 결정을 내릴때, 정렬된 데이타베이스에 동정하고자 하는 균의 염기서열을 분석하여 데이터베이스에 추가시킨 후에 다시 염기서열 정렬을 수행한 후 계통도를 완성하면 해당되는 균종에 근접하여 가지를 형성하게 되어 계통도로 균종을결정할 수도 있다.
[0030] 따라서, 본 발명으로 분석된 19주의 감자 더뎅이 병원성 균의 306-bp rpoB 염기서열 데이터베이스와 이를 이용한 비교 염기서열방법은 감자 더뎅이 병원성 균을 종 수준 혹은 그 이하의 유전형 수준까지의 동정에 유용하게사용될 수 있을 것으로 사료된다.
[0031] 또한, 본 발명은 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336 번째와 442 번째의 시그네이쳐(signature) 아미노산 서열을 분석하여 감자더뎅이 병원성 균종을 분류하는 방법을 포함한다.
[0032] 즉, 분석된 rpoB 유전자 염기서열의 추론된(deduced) 아미노산 중 336번째와 442번째의 시그네이쳐(signature)아미노산 서열을 분석하여 이 서열이 각각 N(Arg) 또는 S(Ser)이면 감자더뎅이 병원성 균종으로 분류될 수있다.
[0033] 즉, 336 (S) + 442 (S), 336 (N) + 442 (S) 및 336 (N) + 442 (N)의 3가지 그룹으로 분류될 수 있다.
[0034] 본 발명에서 새롭게 밝힌 상기 감자더뎅이 병원성 균종의 분류방법은 염기서열 자체뿐만 아니라, 시그네이쳐 아미노산 염기서열 분석을 통해서도 감자 더뎅이 병원성 균종의 동정에 이용할 수 있기 때문에 감자더뎅이 병원성진단에 매우 유용하리라 기대된다.
[0035] 이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[0036] 참고예: 균주
[0037] 감자에 더뎅이 병을 유발한다고 알려진 스트렙토마이세스 스케비에이 8주, 스트렙토마이세스 에시디스케비에이1주 및 스트렙토마이세스 터지디스케비에이 4주 및 이들 균주에 계통 분류학적으로 밀접한 관계가 있는 스트렙토마이세스 보트로펜시스(S. bottropensis) 1주, 스트렙토마이세스 디사스타토크로모진스(S.disastatochromogenes) 1주, 스트렙토마이세스 에로패이스케비에이(S. europaeiscabiei) 1주, 스트렙토마이세스 이포모애(S. ipomoeae) 1주, 스트렙토마이세스 네야가웬시스(S. neyagawaensis) 1주 및 스트렙토마이세스 스텔리스케비에이(S. stelliscabiei) 1주, 총 19주의 표준균주를 대상으로 하여 rpoB 염기서열을 분석하였고 또한제주도 유래 감자의 더뎅이 병원 조직으로부터 분리된 총 8주의 분리 균주(Jeju PS3, PS4, PS12, H13, H17,H20, H19, H11)를 대상으로 하여 rpoB 염기서열을 분석하였다[표 1, 서열목록 참조].
[0038] 실시예 1: 스트렙토마이세스 속 rpoB 306-bp 분절의 제조
[0039] 1) DNA 추출
[0040] BB/P(Bead beater phenol) 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 균의 집락을 따내, TEN 버퍼(Tris-HCl 10mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM: pH 8.0)에 부유시킨 후에 직경 0.1 mm 초자구(diameter 0.1 mm; BiospecProducts, Bartlesville, Okla., U.S.A.) 100 ㎕(packing volume)와 페놀 : 클로로포름 : 이소프로필알코올(50:49:1) 용액 100 ㎕를 함께 부유시켜 mini beater로 1분간 진탕하여 균체를 파쇄하였다. 균 파쇄액은12000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상청액 100 ㎕을 새로운 튜브에 옮긴 후, 60 ㎕의 이소프로필알코올을 섞고,다시 15000 rpm으로 15 분간 원심분리하였다. 침전물은 70% 에탄올로 세척한 후 TE(pH 8.0, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 버퍼 60 ㎕로 DNA를 회수하였다.2) 중합효소 연쇄반응에 [0041] 의한 rpoB 유전자 증폭
[0042] 전의 논문 및 특허에서 소개된 모든 스트렙토미세스 속 균종의 352-bp rpoB 유전자 분절을 증폭시킬 수 있는 특이적인 정방향 프라이머(SRPOF1)와 역방향 프라이머(SRPOR1)를 제조하여 사용하였다. 이미 발표된Streptomyces coelicolor 의 RNA 중합효소 염기 서열의 (AL160431) 코돈 357의 2 번째 염기부터 코돈 364의 3번째 염기까지의 20 개의 염기를 프라이머쌍 정방향 프라이머 SRPOF1(5'-TCGACCACTTCGGCAACCGC-3': 서열번호1)로 코돈 474의 두 번째 염기부터 코돈 468의 첫 번째 염기 까지 20개의 염기를 역방향 프라이머 SRPOR1(5'-TCGATCGGGCACATGCGGCC-3': 서열번호 2)로 하여 프라이머 쌍을 제조하였다. PCR 반응은 2 U의 Taq중합효소, 10 mM dNTP, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2를 포함하는 AccuPower PCR PreMix(Bioneer,Korea)를 이용하였다. 주형 DNA 50 ng, 프라이머 SRPOF1, SRPOR2 각각 20 pmol 넣고, 증류수를 최종 부피 20 ㎕가 되도록 첨가하여 혼합물을 만들었다. PCR은 첫 번째 변성(first denature) 95 ℃로 5분, 30 사이클로 열변성(enaturation) 95 ℃ 1분 결합(anealing) 62 ℃ 45초, 신장(extention) 72 ℃ 1분 30초, 마지막신장(final extention) 72 ℃ 5분으로 수행하였다[Model 9600 thermocycler, Perkin-Elmer cetus].
[0043] 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 19주의 감자 더뎅이 병원성 표준 균주 및 8주의 분리 균주에서 352-bp의rpoB 유전자 분절을 생산함을 1% 아가로스 겔 전기영동 상에서 확인할 수 있었다[도 1].
[0044] 3) 중합효소 연쇄반응 산물의 정제
[0045] 1% 겔에 전기영동 후, 스트렙토마이세스 감자 더뎅이 병원성 표준 균주 352-bp의 반응산물 부위의 겔을 자른 다음 새로운 튜브에 옮겨 DNA을 추출하였다. DNA 추출 및 정제는 Qiaex(Qiagen, Germany) 시스템을 이용하였
다. Gel solubilizing solution QX1 500 ㎕을 겔을 포함한 튜브에 첨가한 후 50 ℃에 15분간 방치하여 겔을 완전히 녹였다. 그 후 겔 비드를 10 ㎕을 첨가하여 완전히 섞은 후에 50 ℃에 15분간 방치하였다.그 사이 1분 간격으로 튜브를 10초씩 vortex를 수행하여 비드가 골고루 퍼지도록 하였다. 이 후 QX1으로 1번, QF로 2번 세척한 후 45 ℃에서 10분간 말린 후 TE 버퍼 20 ㎕로 DNA을 회수하였다.
[0046] 실시예 2: rpoB 분절의 자동염기서열 분석
[0047] 자동 염기서열 분석은 겔 용출 산물을 주형 DNA로 사용하였다. 주형 DNA 60 ng, 프라이머 1.2 pmol,BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(PE Appied Biosystems) 2 ㎕을 섞고, 증류수를 첨가하여 총 부피 10㎕로 제조하였다. 반응은 Perkin Elmer Cetus 9600을 사용하여, 95 ℃ 10 초, 60 ℃ 10 초, 60 ℃ 4 분으로 25 사이클로 실시하였다. 반응이 끝난 샘플은 에탄올 침전방법으로 DNA를 정제하였다. 즉, 증류수180 ㎕, 3M 소듐 아세테이트 10 ㎕을 첨가하여 총 200 ㎕로 만든 후, 이 혼합물에 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 잘 섞은 다음 15000 rpm으로 20분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 그 후 70% 에탄올 500 ㎕을첨가한 후 15000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 DNA를 세척하였다. 그 후 DNA를 Deionized Formimide(PEAppied Biosystems)로 회수하였다. 이렇게 정제된 DNA를 95 ℃로 5분간 반응하여 단일가닥 DNA로 만든 후,ABI 3100 시스템을 이용하여 2시간 30분 동안 전기 영동하여 염기서열을 분석하였다.
[0048] 염기서열 분석 방법은 정방향 및 역방향 프라이머 SRPOF1 및 SRPOR1을 사용하여 양쪽으로 염기서열을 분석하였고, 전체 352-bp 중에서 306-bp의 염기서열을 결정하였다.
[0049] 증폭된 중합효소 연쇄반응 산물을 전기에서 상술한 대로 정제한 후 클로닝 과정 없이 직접 자동염기서열분석 방법으로 스트렙토미세스 시엘리칼라의 전체 rpoB 염기서열 순서를 기준으로 367번째 코돈의 2 번째 염기에서 467코돈의 첫 번째 염기까지 306-bp의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 어떤 모호한 결과(표적유전자가genome 상에 여러 개 존재하고, 그들 사이의 염기서열이 다르면 다른 부위의 염기서열은 직접 염기서열 분석 상에서 염기서열이 겹쳐 나오기 때문에 정확한 염기서열을 결정할 수 없다) 없이 27주 모두 306-bp의 염기를 성공적으로 결정할 수 있었다.
[0050] 실시예 3: 감자 더뎅이병 분리 균주 8 주의 306-bp rpoB 유전자 비교염기서열 분석에 의한 균 동정 및 계통도작성
[0051] 완성된 48주의 표준균주 데이터베이스[스트렙토미세스 표준 균주 29주, 19주(본 발명)]가 실제로 균 동정에 적용될 수 있는 지를 확인하기 위하여, 상기 표 1에서 보여지는 것처럼 제주도 분리 균주 8주(Jeju PS3, PS4,PS12, H13, H17, H20, H19, H11)의 감자더뎅이 병원성 균을 대상으로 rpoB 유전자 비교염기서열 분석 방법에 의해 균 동정을 실시하였다.그 결과, 8주 모두 감자 더뎅이 병원성 균인 세 개의 균종(S. scabiei, S.

[0052] acidiscabies 및 S.turgidiscabies)에 속함을 확인할 수 있었다. 총 8주 중에서 6주[PS3, PS4, PS12, H13, H17, H20]는 서로98.4 ∼ 100%의 염기서열 상동성을 보이면서 그룹 스트렙토미세스 에시디스케비에이(S. acidiscabiei)로 동정되었다. 이 들 중에서 1주(H19)는 스트렙토미세스 투르지디스케비이(S. turgidiscabiei)의 대표 표준균주인ATCC700248T와 99.7%의 염기서열 상동성을 보이면서 이 균으로 동정되었다. 나머지 1주(H11)는 스트렙토미세스 스케비이(S. scabiei) 표준균주인 IFO13767과 100%의 염기서열 상동성을 보이면서 스트렙토미세스 스케비이 그룹 Ⅲ에 속하였다[도 2].
[0053] 따라서, 본 발명으로 분석된 19주의 감자 더뎅이 병원성 균의 306-bp rpoB 염기서열 데이터베이스와 이를 이용한 비교 염기서열방법은 감자 더뎅이 병원성 균을 종 수준으로의 동정에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
[0054] 계통도는 MEGA 2.1 software를 이용하여 Neighbor-Joining Method 방법으로 분석하여 결과를 얻었다[도 3].
[0055] 실시예4 : 감자더뎅이 병원성 균종을 4가지 군으로 분류하는 방법
[0056] 분석된 rpoB 유전자 염기서열을 DNASTAR 소프트웨어의 MegAlign 프로그램을 사용하여 분석한 후 101개의 아미노산으로 다중염기서열을 분석하였다. 19개의 표준 균주의 아미노산 서열은 염기서열 보다 보존(conserved)되어 있었고, 다중염기서열 분석을 통해 98.0에서 100% 까지의 아미노산 서열의 상동성을 보였다. 101개의 아미노산 중 두개의 코돈에서 다양성을 보였고, 이 두 코돈은 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces
coelicolor)[Genbank no. AL160431]의 RNA 중합효소의 336과 442번과 일치한다[표 1]. 특히, 442번 코돈은스트렙토마이세스 종의 리팜핀에 자연적으로 내성을 가지는 것과 연관있는 코돈이다.
[0057] 이 두개 코돈의 아미노산 서열의 다양성에 따라서 19개의 표준균주는 3개의 그룹으로 나뉘어 진다; 336 (S) +442 (S), 336 (N) + 442 (S), 및 336 (N) + 442 (N).
[0058] 336 (S) + 442 (S) 그룹은 야생형(wild type) RpoB 아미노산 서열에 따른 것으로 12개의 균주를 포함하고있다.
[0059] 그룹 I: S. scabiei lc Diastatochromogenes 그룹[S. scabiei 5 strains, Diastatochromogenes group(S.disastatochromogenes, S. ottropensis, and S. neyagawaensis), S. ipomoeae, and S. stelliscabiei]과;
[0060] 그룹 Ⅱ: S. acidiscabiei 그룹 2 균주.
[0061] 336 (N) + 442 (S) 그룹은 S. turgidiscabiei 그룹 3 균주(S. turgidiscabiei 3 strains)와 S.europaeiscabiei 및 S. scabiei IFO3111을 포함하고 있다.
[0062] 마지막으로 336 (N) + 442 (N) 그룹은 리팜핀(rifampin)에 내성을 가지는 유형으로 두 개의 S. scabiei(ATCC23962 and DSMZ 40960) 균주를 포함한다[도 4 참조].
도면의 간단한 설명
[0063] 도 1은 스트렙토마이세스 속 특이적 프라이머를 이용한 감자 더뎅이 병원성 균종으로 알려진 표준균주 DNA의352-bp 유전자 분절 증폭산물을 전기영동 사진으로 나타낸 것이다[M : 100 bp 마커, lane 1:S. scabiei KACC20101T, lane 2 : S. scabiei IFO 12914 ,lane 3 :S. scabiei IFO 3111, lane 4 :S. scabiei IFO 13767, lane

5 : S. scabiei IFO 13768, lane 6 : S. scabiei KACC 20135, lane 7 : S. scabiei DSMZ 40960, lane 8 : S.scabiei KACC20227, lane 9 : S. acidiscabies KACC20125T , N : nagetive].
[0064] 도 2는 제주도 분리균주 8주의 염기서열 상동성 결과를 나타낸 것이다.
[0065] 도 3는 스트렙토마이세스 표준균주 30주와 본 발명에서 분석한 감자 더뎅이 병원성 표준균주 19주 및 분리균주8주의 rpoB 306-bp 염기서열로 구성된 계통도를 나타낸 것이다.
[0066] 도 4는 감자더뎅이 병원성 균종을 4가지 군으로 분류하는 방법을 계통도로 나타낸 것이다.
도면
도면1
도면2
도면3
도면4
서 열 목 록
<110> Seoul National University Industry Foundation Jeju Hi-Tech Industry Development Institute
<120> Identification method of genus streptomyces by using rpoB gene
<160> 29
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRPOF1
<400> 1
tcgaccactt cggcaaccgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRPOR1
<400> 2
tcgatcgggc acatgcggcc 20
<210> 3
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei ATCC 49173T
<400> 3
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300

cgcact 306
<210> 4
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei IFO 12914
<400> 4
tccgtaacgt cggtgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gtgtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctgacgca caagcgtcgt ctgaacgccc 240
tcggcccggg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgcgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 5
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei IFO 3111
<400> 5
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtccg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctctcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcg cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 6
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei IFO 13767
<400> 6
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 7
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei IFO 13768
<400> 7
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtggaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtggtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 8
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei DSMZ 40778
<400> 8
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgaccca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 9
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei DSMZ 40960
<400> 9
tccgcaacgt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctgacgca caagcgtcgt ctgaacgccc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 10
<211> 306
<212> DNA
<213> S. scabiei DSMZ 40962
<400> 10
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtggtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 11
<211> 306
<212> DNA
<213> S. acidiscabies ATCC 49003T
<400> 11
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 12
<211> 306
<212> DNA
<213> S. turgidiscabies ATCC 700249T
<400> 12
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 13
<211> 306
<212> DNA
<213> S. turgidiscabies IFO 16079
<400> 13
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 14
<211> 306
<212> DNA
<213> S. turgidiscabies IFO 16080
<400> 14
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 15
<211> 306
<212> DNA
<213> S. turgidiscabies IFO 16081
<400> 15
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg accactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 16
<211> 306
<212> DNA
<213> S. bottropensis IFO 13023
<400> 16
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 17
<211> 306
<212> DNA
<213> S. diastatochromogenes IFO 13389
<400> 17
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcac 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 18
<211> 306
<212> DNA
<213> S. europaeiscabiei CFBP 4497
<400> 18
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggcctggcg cggatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgagac gtgcacccgt 300
cccact 306
<210> 19
<211> 306
<212> DNA
<213> S. ipomoeae IFO 13050
<400> 19
tgggcagggt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtggaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtggtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtccg ggctgacgca caagcgtcgt ctgtccgcgc 240
tcggcccggg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
ctcact 306
<210> 20
<211> 306
<212> DNA
<213> S. neyagawaensis IFO 3784
<400> 20
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctctcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcg cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cgcact 306
<210> 21
<211> 306
<212> DNA
<213> S. stelliscabiei CFBP 4521
<400> 21
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgcgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 22
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju PS3
<400> 22
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 23
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju PS4
<400> 23
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 24
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju PS12
<400> 24
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 25
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju H13
<400> 25
tccgcaacgt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 26
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju H17
<400> 26
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gggtcgtgcg tgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggcgc 240
tcggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 27
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju H20
<400> 27
tgcggtcggt cggcgagctg atccagaacc aggtccgtac gggtctcgcc cgtatggagc 60
gcgtcgtgcg cgagcgcatg accacccagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgc ctctcggcgc 240
tcggtccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 28
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju H19
<400> 28
tgcgcaacgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgactcagg acgtcgaggc gatcacgccg cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctcaccca caagcgccgt ctgtcggctc 240
ttggcccggg tggtctctcc cgtgagcggg ccggcttcaa ggtccgtgac gtgcacccct 300
cgcact 306
<210> 29
<211> 306
<212> DNA
<213> Jeju H11
<400> 29
tgcgcagcgt cggcgagctc atccagaacc aggtccgtac gggtctggcg cgtatggagc 60
gtgtcgtccg cgagcgcatg acgacccagg acgtcgaggc gatcacgccc cagaccctga 120
tcaacatccg gccggtcgtc gcctccatca aggagttctt cggcaccagc cagctgtcgc 180
agttcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg gtctgacgca caagcgtcgt ctctcggcgc 240
tgggtcccgg tggtctgtcc cgtgagcggg ccggcttcga ggtccgtgac gtgcacccgt 300
cccact 306